Визначення вітамінів у продуктах харчування та комбікормах для тварин

Вітаміни – це біологічно активні органічні сполуки, які є важливими компонентами раціону та є необхідними складовими для нормального метаболізму в організмі людини та тварин. Вони поділяються на дві основні групи: водо- та жиророзчинні.

Водорозчинні вітаміни включають вітаміни групи В (тіамін/В1, рибофлавін/В2, нікотинамід/нікотинова кислота/В3, пантотенова кислота/В5, піридоксин/піридоксаль гідрохлорид/В6, фолієва кислота/В9 та ціанокобаламін/В12) та аскорбінова кислота (вітамін С). До жиророзчинних вітамінів належать ретинол (вітамін А), токоферол (вітамін Е), кальциферол (вітамін D) і антигеморагічні вітаміни (вітамін К).

Споживання вітамінів залежить від раціону. Однак навіть продукти, які містять необхідні вітаміни, можуть мати знижений вміст цих сполук  після зберігання, обробки або приготування. Щоб доповнити свій раціон, багато людей вживають полівітамінні добавки, або продукти, що спеціально збагачені вітамінами. Для визначення вмісту вітамінів у продуктах харчування та контролю якості  полівітамінних комплексів існує ряд надійних методів аналізу.

Вітаміни відіграють також велику роль у вигодовуванні тварин. Вивчення хімічного складу кормів у практиці тваринництва є одним із найважливіших елементів оцінки їхньої поживної цінності. Знаючи його, можна зробити висновок про те, які з поживних речовин і в якій кількості містяться у кормі, а звідси — якою мірою вони задовольнятимуть потребу тварин у тих чи інших елементах живлення. Тому досить важливо контролювати вміст вітамінів у кормах для тварин.

Загальні підходи до визначення вітамінів

Для кількісного визначення вітамінів використовують інструментальні методи, у першу чергу – спектроскопію та рідинну хроматографію. 

Метод спектрофотометрії є найпростішим, він полягає в утворенні комплексу з певним вітаміном, що поглинає при певній довжині хвилі, і детектуванні інтенсивності поглинання. Слід зауважити, що за допомогою однієї реакції можна визначити лише один вітамін: немає можливості одночасного визначення груп вітамінів. Метод дає надійні результати щодо більшості вітамінів. Істотним недоліком спектрометричних методів є недостатня вибірковість та низька чутливість, що ускладнює точне визначення вмісту вітамінів, особливо в низьких концентраціях. 

Золотим стандартом визначення вітамінів є метод високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), який дозволяє визначати декілька вітамінів одночасно. Суть методу полягає у розділенні речовин досліджуваної суміші між рідиною і твердим сорбентом. Залежно від їх полярності, розрізняють нормально-фазову (коли рідина є неполярною, а сорбент – полярний) та обернено-фазову хроматографію. 

Висока чутливість і точність методу забезпечують надійні результати у випадках, коли інші методи малопридатні. Крім цього ВЕРХ дає можливість розділення різних форм вітамінів (наприклад, під поняттям «вітамін А» розуміють ретинол, його ізомери, ацетат та пальмітат ретинолу, а також провітамін А – β-каротин та інші сполуки), що особливо необхідно при контролі за внесенням вітамінів у харчові продукти. Тому нижче буде розглянуто певні аспекти пробопідготовки та хроматографічного визначення водо- та жиророзчинних вітамінів у продуктах харчування, харчових добавках та комбікормах для тварин.

Визначення жиророзчинних вітамінів

Для аналізу вітамінів методом ВЕРХ можна використовувати як нормально-фазову (НФ-ВЕРХ), так і обернено-фазову (ОФ-ВЕРХ) хроматографію. Наразі переважна більшість міжнародних стандартів по визначенню жиророзчинних вітамінів посилається саме на нормально-фазову ВЕРХ (див. Табл. 1).

Табл. 1

Однак, обернено-фазова ВЕРХ є більш оптимальною системою з точки зору відтворюваності часів утримання, швидкого врівноваження та надійності колонок. До того ж, ОФ-ВЕРХ застосовується у понад 80% хроматографічного аналізу в світі. Оскільки вітамін E має 4 ізомери (α, β, γ, δ), єдиним обмеженням ОФ-ВЕРХ є неможливість розділити β- і γ-ізомери. Однак у більшості випадків важливе визначення саме суми всіх токоферолів, тому на практиці перевагу у визначенні жиророзчинних вітамінів все ж надають методикам з оберненою фазою та флуоресцентним або фотометричним детектуванням.

Відповідно до раніше перерахованих міжнародних стандартів, пробопідготовка харчових продуктів та комбікормів для визначення у них вітамінів А та Е полягає в омиленні аналізованої проби спиртовим розчином лугу та екстрагування вітамінів діетиловим або петролейним етером. Сухий залишок після відгонки розчинника перерозчиняють в іншому розчиннику та вводять в хроматограф. Ці методи мають переваги з точки зору точності, але характеризуються також значними недоліками. Їхні експериментальні процедури займають багато часу, а собівартість аналізу зависока через велику кількість реагентів та органічних розчинників. Тому в останні роки увага багатьох науковців і виробників хроматографічних систем приділена пошуку більш простих методик аналізу.

Так, існує ряд публікацій, у яких описуються швидкі і прямі методи визначення вітамінів A та E в олії та маслі за допомогою обернено-фазової рідинної хроматографії. Ці методи мають спрощену пробопідготовку, що полягає лише у розчиненні зразка у відповідному розчиннику без попереднього омилення. Таким чином, тривалість підготовки скорочується від двох годин до 15 хв.

Метод високоефективної рідинної хроматографії дозволяє визначати жиророзчинні вітамінів A, D, E одночасно. Так, національний стандарт GB 5413.9-2010 описує визначення цих вітамінів у продуктах харчування для немовлят та в молочних продуктах. Великим недоліком даного стандарту, як і інших стандартів по визначенню вітаміну D, є додаткова хроматографічна очистка екстракту в умовах нормально-фазової хроматографії. Тож мова йде фактично про використання двох хроматографів для визначення одного вітаміну, що є економічно недоцільно. 

Рідинний хроматограф Vanquish Core

Тому компанія Thermo Fisher Scientific пропонує альтернативне економне та надійне рішення для одночасного визначення вітамінів A, D, E у продуктах харчування за допомогою однієї ВЕРХ-системи (2D-HPLC), при цьому очистка екстракту проводиться на хроматографі онлайн без участі оператора та без використання додаткового обладнання для екстракції.

Ознайомитися з системою Vanquish Core можна на нашому сайті.

Нижче наведено порівняння результатів, отриманих запропонованим методом (2D-HPLC) та стандартним (GB метод). Дане рішення також підходить для визначення жиророзчинних вітамінів у інших матрицях, зокрема у кормах для тварин.

Табл. 2

Визначення водорозчинних вітамінів

Для визначення вітамінів B та C також застосовується метод обернено-фазової ВЕРХ з УФ детектуванням. Пробопідготовка для харчових продуктів та комбікормів для тварин зазвичай полягає у екстрагуванні цільових компонентів підкисленими водними розчинами.

Особлива увага приділяється визначенню вітаміну В12 у продуктах харчування та біодобавках, оскільки його вміст здебільшого знаходиться на дуже низькому рівні. Таким чином, традиційного методу ВЕРХ недостатньо для визначення вітаміну у більшості зразків. Національним стандартом ДСТУ EN 12821:2005 передбачено як один із етапів пробопідготовки зразка використання твердофазної екстракції (ТФЕ) для його концентрування. У такому випадку постає необхідність у використанні додаткового обладнання, що підвищує собівартість аналізу і збільшує час пробопідготовки.

Тому компанія Thermo Fisher Scientific пропонує методику онлайн-ТФЕ для визначення вітаміну B12, що проводиться автоматично на рідинному хроматографі без додаткової участі оператора. Використовуючи дане рішення, вдалося знизити мінімально визначувану концентрацію вітаміну в комбікормах для тварин з 7 мкг/кг до 50 нг/кг, тобто близько в 140 разів.

Комплексне рішення для одночасного визначення вмісту жиро- і водорозчинних вітамінів

Можна зробити хибний висновок, що визначення вітамінів є інколи складною і дороговартісною процедурою навіть при визначенні однієї групи вітамінів. А скільки хроматографів та часу потрібно для визначення і водо- і жиророзчинних сполук? 

Компанія Thermo Fisher вже відповіла на це питання та розробила інтегроване та ефективне рішення для одночасного визначення водо- та жиророзчинних вітамінів у різних типах зразків, зокрема таблетках, напоях та комбікормах для тварин. Так, для такого аналізу треба лише один хроматограф і мінімум часу. 

Одночасне визначення проводиться в одній послідовності, використовуючи режим перемикання колонок і клапанів та другу інжекцію під час аналізу. Перевагами даного методу є мінімальна пробопідготовка зразка: необхідне лише розчинення наважки у відповідному розчиннику та фільтрування проби; а також експресність визначення – до 20 сполук за 20 хв (див. приклад хроматограми на Рис). Враховуючи підготовку проби, сумарний час від отримання зразка лабораторією до видачі результату складає до 1 год, тоді як класичні методи передбачають декількагодинну пробопідготовку та аналіз на двох хроматографах.

Використання ВЕРХ-МС-МС для визначення вітамінів

У описаних вище хроматографічних методах вітаміни визначаються за допомогою фотометричного чи флуоресцентного детекторів. Принципи детектування базуються на здатності сполук поглинати чи випромінювати світло певних довжин хвиль, ця здатність обумовлена безпосередньо будовою молекули. Флуоресціювати можуть лише декілька вітамінів, зокрема рибофлавін і піридоксин, токоферол та ретинол, деякі стають флуоресцентними після дериватизації (тіамін). Однак, є сполуки що не тільки не флуоресціюють, а й слабо поглинають світло. Тож визначення таких вітамінів, зокрема пантотенової кислоти (вітамін В5), залежить від матриці і в деяких випадках є неможливим.

Тоді на допомогу приходить ВЕРХ-МС-МС (високоефективна рідинна хроматографія та тандемна мас-спектрометрія). Цей метод широко застосовується для кількісного аналізу вітамінів у харчових продуктах або біологічних рідинах і відомий завдяки своїй високій селективності та чутливості.

Рідинний хроматограф Vanquish Flex та мас-спектрометр TSQ Altis

Thermo Fisher Scientific пропонує обладнання для кількісного визначення вітамінів на рівнях мг/кг і мкг/кг. Окрім зниження лімітів детектування та меншої тривалості аналізу, використання ВЕРХ-МС-МС дозволяє розширити коло визначуваних речовин до похідних вітамінів.

Наприклад, типові ВЕРХ-УФ методики для визначення вітамінів групи D не поширюються на 25-гідроксивітамін D і 1,25-дигідроксивітамін D, що також володіють провітамінною активністю. У той час використання мас-спектрометрії дає можливість визначити не лише 4 вищезгаданих сполуки (спільно з D2 та D3), а й спростити пробопідготовку зразків, зокрема знехтувати етапом хроматографічного очищення.

Ознайомитись з рідинними трьохквадрупольними хроматографічними мас-спектрометрами серії TSQ можна на нашому сайті. 

Компанія «АЛТ Україна ЛТД» – офіційний дистриб’ютор Thermo Fisher Scientific – постачає рішення для пробопідготовки та визначення вітамінів у будь-якій матриці. Фахівці компанії проводять навчання персоналу лабораторії, що дає змогу підприємству заощадити час та гроші, а також розпочати отримувати результати у короткі терміни.

Ганна Бакал

Спеціаліст департаменту хроматографії та спектроскопії

Спеціалізація: аналітичне обладнання, хроматографія, мас-спектрометрія.