Определение витаминов в продуктах питания и комбикормах для животных

Витамины – это биологически активные органические соединения, являющиеся важными компонентами рациона и необходимыми составляющими для нормального метаболизма в организме человека и животных. Они делятся на две основные группы: водо- и жирорастворимые.

Водорастворимые витамины включают витамины группы В (тиамин/В1, рибофлавин/В2, никотинамид/никотиновая кислота/В3, пантотеновая кислота/В5, пиридоксин/пиридоксаль гидрохлорид/В6, фолиевая кислота/В9 и цианокобаламин/В12) и аскорбиновая кислота (витамин С). К жирорастворимым витаминам относятся ретинол (витамин А), токоферол (витамин Е), кальциферол (витамин D) и антигеморрагические витамины (витамин К).

Потребление витаминов зависит от рациона. Однако даже продукты, содержащие необходимые витамины, могут иметь пониженное содержание этих соединений после хранения, обработки или приготовления. Чтобы дополнить свой рацион, многие люди употребляют поливитаминные добавки или продукты, специально обогащенные витаминами. Для определения содержания витаминов в продуктах питания и контроля качества поливитаминных комплексов существует ряд надежных методов анализа.

Витамины играют также огромную роль в процессе вскармливания животных. Изучение химического состава кормов в практике животноводства является одной из важнейших частей оценки их питательной ценности. Зная его, можно понять, какие из питательных веществ и в каком количестве содержатся в корме, а отсюда — в какой степени они будут удовлетворять потребность животных в тех или иных элементах питания. Поэтому очень важно контролировать содержание витаминов в кормах для животных.

Общие подходы в определении витаминов

Для количественного определения витаминов используют инструментальные методы, в первую очередь спектроскопию и жидкостную хроматографию.

Метод спектрофотометрии является самым простым, он заключается в образовании комплекса с определенным витамином, поглощаемым при определенной длине волны, и детектировании интенсивности поглощения. Следует заметить, что при помощи одной реакции можно найти только один витамин: нет способности одновременного определения групп витаминов. Метод дает надежные результаты по большинству витаминов. Существенным недостатком спектрометрических методов является недостаточная избирательность и низкая чувствительность, что затрудняет точное определение витаминов, особенно в низких концентрациях.

Золотым стандартом определения витаминов является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), позволяющий определять несколько витаминов одновременно. Суть метода состоит в разделении веществ исследуемой смеси между жидкостью и твердым сорбентом. В зависимости от их полярности различают нормально-фазовую (когда жидкость неполярная, а сорбент – полярный) и обратно-фазовую хроматографию.

Высокая чувствительность и точность метода обеспечивают надежные результаты в тех случаях, когда другие методы малопригодны. Кроме этого ВЭЖХ дает возможность разделения различных форм витаминов (например, под понятием «витамин А» понимают ретинол, его изомеры, ацетат и пальмитат ретинола, а также провитамин А – β-каротин и другие соединения), что особенно необходимо при контроле за внесением витаминов в пищевые продукты. Поэтому ниже будут рассмотрены определенные аспекты пробоподготовки и хроматографического определения водо- и жирорастворимых витаминов в продуктах питания, пищевых добавках и комбикормах для животных.

Определение жирорастворимых витаминов

Для анализа витаминов методом ВЭЖХ можно использовать как нормально-фазовую (НФ-ВЭЖХ), так и обратно-фазовую (ОФ-ВЭЖХ) хроматографию. Подавляющее большинство международных стандартов по определению жирорастворимых витаминов ссылается именно на нормально-фазовую ВЭЖХ (см. Табл. 1).

Табл. 1

Обратно-фазовая ВЭЖХ является более оптимальной системой с точки зрения воспроизводимости времен удерживания, быстрого уравновешивания и надежности колонок. К тому же, ОФ-ВЭЖХ применяется более чем в 80% хроматографического анализа в мире. Поскольку витамин E имеет 4 изомера (α, β, γ, δ), единственным ограничением ОФ-ВЭЖХ является невозможность разделить β- ​​и γ-изомеры. Однако в большинстве случаев важно определение именно суммы всех токоферолов, поэтому на практике предпочтение в определении жирорастворимых витаминов все же отдают методикам с обратной фазой и флуоресцентным или фотометрическим детектированием.

Согласно ранее перечисленным международным стандартам, пробоподготовка пищевых продуктов и комбикормов для определения в них витаминов А и Е заключается в омылении анализируемой пробы спиртовым раствором щелочи и экстрагировании витаминов диэтиловым или петролейным эфиром. Сухой остаток после отгонки растворителя перерастворяют в другом растворителе и вводят в хроматограф. Эти методы обладают преимуществами с точки зрения точности, но характеризуются также значительными недостатками. Их экспериментальные процедуры занимают много времени, а себестоимость анализа слишком высока из-за большого количества реагентов и органических растворителей. Поэтому в последние годы внимание многих ученых и производителей хроматографических систем уделено поиску более обычных методик анализа.

Да, существует ряд публикаций, в которых описываются быстрые и прямые методы определения витаминов A и E в масле с помощью обратно-фазовой жидкостной хроматографии. Эти методы имеют упрощенную пробоподготовку, заключающуюся только в растворении образца в соответствующем растворителе без предварительного омыления. Таким образом, продолжительность подготовки сокращается от двух часов до 15 мин.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет определять жирорастворимые витамины A, D, E одновременно. Так, национальный стандарт GB 5413.9-2010 описывает определение этих витаминов в продуктах питания для младенцев и молочных продуктах. Большим недостатком данного стандарта, как и других стандартов по определению витамина D, является дополнительная хроматографическая очистка экстракта в условиях нормально-фазовой хроматографии. Поэтому речь идет фактически об использовании двух хроматографов для определения одного витамина, что экономически нецелесообразно.

Жидкостный хроматограф Vanquish Core

Поэтому компания Thermo Fisher Scientific  предлагает альтернативное экономное и надежное решение для одновременного определения витаминов A, D, E в продуктах питания с помощью одной ВЭЖХ-системы (2D-HPLC), при этом очистка экстракта производится на хроматографе онлайн без участия оператора и без использования дополнительного оборудования для экстракции.

Ознакомиться с системой Vanquish Core можно на нашем сайте.

Ниже представлены сравнения результатов, полученных предложенным методом (2D-HPLC) и стандартным (GB метод). Данное решение подходит для определения жирорастворимых витаминов в других матрицах, в частности в кормах для животных.

Табл. 2

Определение водорастворимых витаминов

Для определения витаминов B и C также применяется метод обратно-фазовой ВЭЖХ с УФ детектированием. Пробоподготовка для пищевых продуктов и комбикормов для животных обычно заключается в экстрагировании целевых компонентов подкисленными водными растворами.

Особое внимание уделяется определению витамина В12 в продуктах питания и биодобавках, поскольку его содержание в большинстве своем находится на очень низком уровне. Таким образом, традиционного метода ВЭЖХ недостаточно для определения витамина в большинстве образцов. Национальный стандарт ДСТУ EN 12821:2005 предусмотрен как один из этапов пробоподготовки образца с использованием твердофазной экстракции (ТФЭ) для его концентрирования. В таком случае возникает необходимость в использовании дополнительного оборудования, что повышает себестоимость анализа и увеличивает время пробоподготовки.

Поэтому Thermo Fisher Scientific предлагает методику онлайн-ТФЭ для определения витамина B12, проводимую автоматически на жидкостном хроматографе без дополнительного участия оператора. Используя данное решение, удалось снизить минимально определяемую концентрацию витамина в комбикормах для животных с 7 мкг/кг до 50 нг/кг, то есть примерно в 140 раз.

Комплексное решение для одновременного определения содержания жиро- и водорастворимых витаминов

Можно сделать ложный вывод, что определение витаминов является иногда сложной и дорогостоящей процедурой даже при определении одной группы витаминов. А сколько хроматографов и времени требуется для определения водо- и жирорастворимых соединений?

Компания Thermo Fisher уже ответила на этот вопрос и разработала интегрированное и эффективное решение для одновременного определения водо- и жирорастворимых витаминов в различных типах образцов, включая таблетки, напитки и комбикорма для животных. Да, для такого анализа требуется только один хроматограф и минимум времени.

Одновременное определение производится в одной последовательности, используя режим переключения колонок и клапанов и вторую инжекцию при анализе. Преимуществами данного метода является минимальная пробоподготовка образца: необходимо только растворение навески в соответствующем растворителе и фильтрование пробы; а также экспрессность определения – до 20 соединений в 20 мин (см. пример хроматограммы на Рис.). Учитывая подготовку пробы, суммарное время от получения образца лабораторией до выдачи результата составляет до 1 часа, тогда как классические методы предусматривают несколько часовую пробоподготовку и анализ на двух хроматографах.

Использование ВЭЖХ-МС-МС для определения витаминов

В описанных выше хроматографических методах витамины определяются с помощью фотометрического или флуоресцентного детектора. Принципы детектирования базируются на способности соединений поглощать или излучать свет определенных длин волн, эта способность обусловлена ​​строением молекулы. Флуоресцировать могут лишь несколько витаминов, в частности рибофлавин и пиридоксин, токоферол и ретинол, некоторые становятся флуоресцентными после дериватизации (тиамина). Однако, есть соединения не только не флуоресцирующие, но и слабо поглощающие свет. Поэтому определение таких витаминов, в частности пантотеновой кислоты (витамин В5), зависит от матрицы и в некоторых случаях является невозможным.

Тогда на помощь приходит ВЭЖХ-МС-МС (высокоэффективная жидкостная хроматография и тандемная масс-спектрометрия). Этот метод широко применяется для количественного анализа витаминов в пищевых продуктах или биологических жидкостях и известен благодаря высокой селективности и чувствительности.

Жидкостный хроматограф Vanquish Flex и масс-спектрометр TSQ Altis

Thermo Fisher Scientific предлагает оборудование для количественного определения витаминов на уровнях мг/кг и мкг/кг. Кроме снижения лимитов детектирования и меньшей продолжительности анализа использование ВЭЖХ-МС-МС позволяет расширить круг определяемых веществ до производных витаминов.

Например, типичные ВЭЖХ-УФ методики для определения витаминов группы D не распространяются на 25-гидроксивитамин D и 1,25-дигидроксивитамин D, которые также обладают провитаминной активностью. В то время использование масс-спектрометрии позволяет определить не только 4 вышеупомянутых соединения (совместно с D2 и D3), но и упростить пробоподготовку образцов, в частности пренебречь этапом хроматографической очистки.

Ознакомиться с жидкостными трехквадрупольными хроматографическими масс-спектрометрами серии TSQ можно на нашем сайте.

Компания «АЛТ Украина ЛТД» – официальный дистрибьютор Thermo Fisher Scientific – поставляет решения для пробоподготовки и определения витаминов в любой матрице. Специалисты компании проводят обучение персонала лаборатории, что позволяет предприятию сэкономить время и деньги, а также начать получать результаты в короткие сроки.

Анна Бакал

Специалист департамента хроматографии и спектроскопии

Специализация: аналитическое оборудование, хроматография, масс-спектрометрия.