Мікросателітна нестабільність як важливий діагностичний маркер у практиці сучасної патогістологічної лабораторії

Мікросателітна нестабільність (microsatellite instability, MSI) – це патологічний стан клітини, за якого вона має високу схильність до мутацій внаслідок порушення роботи механізмів репарації помилково спарених нуклеотидів.

Під час клітинного поділу у ядрі відбувається реплікація ДНК за участю ферменту полімерази, при цьому можливе утворення помилково спарених нуклеотидів на мікросателітних ділянках. Мікросателіти – це ділянки повторів азотистих основ в геномі, ці ділянки можуть часто повторюватись, дублюватись, і зазвичай не кодують жодних білків. Особливістю мікросателітних повторів є висока частота помилок під час реплікації ДНК через малу довжину мікросателітів та часту повторюваність. Це призводить до утворення гомополімерів різної довжини. У нормі цей процес коригується спеціальною системою білків – DNA mismatch repair, або MMR. 

Система репарації помилково спарених нуклеотидів являє собою абсолютно унікальний механізм виявлення та усунення певних порушень та помилок реплікації ДНК (включення некомплементарних нуклеотидів, утворення коротких делецій або інсерцій і т.д). До DNA mismatch repair системи входять полімерази e, d та комплекс білків, серед яких найбільше значення мають MLH1, MSH2, MSH6 і PMS2. MMR працює не ідеально, але все ж таки розпізнає більшість дефектів в генетичному коді та усуває їх. Якщо білки репарації перестають нормально виконувати свої функції, частота нерозпізнаних мутацій різко зростає – у сотні та тисячі разів.

Найчастіше порушення функціонування MMR системи пов’язане з:

• спадковими мутаціями у генах, які кодують білки цієї системи
• епігенетичними змінами, які знижують активність генів, що кодують MMR білки

Мікросателітна нестабільність була відкрита у 70-80-х роках минулого сторіччя. Першим захворюванням, з доведеними етіологічним чинником MSI стала пігментна ксеродерма — рідкісна спадкова патологія, яка супроводжується підвищенням чутливості шкіри до ультрафіолетового випромінювання та схильністю до розвитку злоякісних пухлин.  У 1993 році в наукових журналах з’явилися роботи, в яких дослідники повідомляли, що мікросателітна нестабільність часто зустрічається при злоякісних пухлинах товстої та прямої кишки. З того часу було проведено багато досліджень, присвячених цій темі. На цей момент відомо, що порушення системи репарації ДНК зустрічається за колоректальної карциноми у 15-20% випадків. Зараз мікросателітна нестабільність офіційно визнана як молекулярний маркер синдрому Лінча (спадкова неполіпозна колоректальна карцинома) – генетичне захворювання, при якому підвищується ризик розвитку раку товстої кишки у віці до 50 років, а також раку яєчників, тонкої кишки, шлунку, шкіри, мозку, сечовивідних шляхів. Пухлини, які виникають в результаті мікросателітної нестабільності є гіпермутованими, вони різняться високим мутаційним навантаженням, але разом з тим вони також накопичують велику кількість неоантигенів, які є мішенями для імунної відповіді. Такі пухлини за гістологічного дослідження характеризуються інтенсивною лімфоцитарною інфільтрацією, що свідчить про інтенсивну запальну реакцію. Оцінка ступеня імуногенності цих пухлин залишається дискусійним питанням, що потребує додаткових досліджень. На зараз описано, що імуногенність пухлин із мікросателітною нестабільністю у 20-50 разів більша ніж у мікросателіт-стабільних. Це свідчить про те, що пухлини із мікросателітною нестабільністю будуть особливо сприйнятливі до імунотерапії. 

Найпоширенішими методами для діагностики мікросателітної нестабільності є:

• імуногістохімічний метод
• ПЛР
• метод NGS

ІГХ метод на сьогодні є найпоширенішим для діагностики MMR через відносну простоту використання, дешевизну та доступність. Для діагностики MMR у пухлині, відповідно до міжнародних рекомендацій, необхідне дослідження 4 найважливіших білків системи: MLH1, MSH2, MSH6 і PMS2. Класичною ознакою позитивної на мікросателітну нестабільність пухлини є парне «випадіння» білків, які формують комплекс системи, а саме: MLH1/PMS2 або MSH2/ MSH6. Однак також можлива велика кількість варіацій, зокрема дефіцитом механізмів репарації неспарених основ ДНК (dMMR) вважається наявність принаймні одного білка з втратою експресії. ІГХ метод доступний у більшості діагностичних гістологічних лабораторій. Антитіла до 4 білків MSI системи від Leica Biosystems демонструють високу специфічність та надійність. 

1. Реакція відсутня: виражене ядерне фарбування в клітинах пухлини. Інтактною експресією MSI вважається повне ядерне фарбування у всіх клітинах пухлини з чітким фарбуванням внутрішнього контролю тканини, прилеглій до новоутворення (рис. 1А);
2. Позитивна реакція або повна втрата експресії: вважається результат, при якому відсутнє або значно зменшене ядерне фарбування в клітинах пухлини порівняно з суміжною нормальною тканиною, яка при цьому демонструє чітке фарбування (рис. 1В);
3. Субклональна втрата експресії була визначена як чітко відмежована регіональна втрата ядерного фарбування зразків пухлини з внутрішньою контрольною тканиною, прилеглою до пухлинних клітин, яка демонструє чітке фарбування (рис. 1C). Субклональна втрата експресії MLH1 свідчить про те, що пухлина гетерогенна, тобто складається з різних популяцій клітин із різними генетичними характеристиками. У цьому контексті, хоча деякі клітини в пухлині можуть зберігати експресію MLH1 і функціональний MMR, інші можуть втратити експресію MLH1 через генетичні або епігенетичні зміни. Ця неоднорідність може мати наслідки для поведінки пухлини, відповіді на терапію та прогнозу захворювання.
4. «Двозначне фарбування» це результат, при якому контрольні тканини та тканини пухлини мають слабке фарбування. Це означає що результат потрібно переробити (рис. 1D).

Рис. 1. Репрезентативні IHC зображення експресії білка MMR.

Усі зображення зроблено зі збільшенням 100×. (взято із: Park Y, Nam SK, Seo SH, Park KU, Oh HJ, Park YS, Suh YS, Ahn SH, Park DJ, Kim HH, Lee HS. Comprehensive Study of Microsatellite Instability Testing and Its Comparison With Immunohistochemistry in Gastric Cancers. J Gastric Cancer. 2023 Apr;23(2):264-274. doi: 10.5230/jgc.2023.23.e5. PMID: 37129151; PMCID: PMC10154139.

Доведено, що етап пошуку антигену є  критично важливим для правильної інтерпретації статусу пацієнта. Часто некоректне зв’язування антитіла з антигеном при проведенні ІГХ призводить до слабкого фарбування та низької специфічності для LS (у той час, як високе фонове фарбування також пов’язано з поганою чутливістю). Іноді зустрічаються слабкі або гетерогенні моделі фарбування, які можуть бути пов’язані з варіаціями у фіксації тканини або слабкими антитілами.  У цих випадках може бути корисним повторне проведення IHC з використанням якісної системи детекції. Антитіла для діагностики мікросателітної нестабільності від Leica Biosystems офіційно рекомендовані Управлінням з контролю за продуктами та ліками США – FDA. Панель антитіл MMR Leica Biosystems MLH1, MSH2, MSH6 та PMS2 була визнана якісною та високочутливою для діагностики при проведенні імуногістохімічного фарбування залитих у парафін зразків тканин людини. Висока якість отриманих результатів підтверджується рекомендаціями FDA, клінічним досвідом лабораторій та наукових установ Європи, Америки та України.

1. Watkins JC, Nucci MR, Ritterhouse LL, Howitt BE, Sholl LM. Unusual mismatch repair immunohistochemical patterns in endometrial carcinoma. Am J Surg Pathol. 2016;40:909–916.
2. Sari A, Pollett A, Eiriksson LR, Lumsden-Johanson B, Van de Laar E, Kazerouni H, et al. Interobserver agreement for mismatch repair protein immunohistochemistry in endometrial and nonserous, nonmucinous ovarian carcinomas. Am J Surg Pathol. 2019;43:591–600.
3. Park Y, Nam SK, Seo SH, Park KU, Oh HJ, Park YS, Suh YS, Ahn SH, Park DJ, Kim HH, Lee HS. Comprehensive Study of Microsatellite Instability Testing and Its Comparison With Immunohistochemistry in Gastric Cancers. J Gastric Cancer. 2023 Apr;23(2):264-274. doi: 10.5230/jgc.2023.23.e5. PMID: 37129151; PMCID: PMC10154139.
4. Hargadon KM, Johnson CE, Williams CJ. Immune checkpoint blockade therapy for cancer: an overview of FDA-approved immune checkpoint inhibitors. Int Immunopharmacol. 2018;62:29–39.
5. Praveen Vikas et al., Mismatch Repair and Microsatellite Instability Testing for Immune Checkpoint Inhibitor Therapy: ASCO Endorsement of College of American Pathologists Guideline. JCO 41, 1943-1948(2023). DOI:10.1200/JCO.22.02462