Методи тканинного типування: серологічний CDC крос-матч та його практичне проведення у лабораторному супроводі трансплантації. Частина 2

В даній статті детально розглянута процедура практичного проведення серологічного Т-клітинного крос-матчу з використанням методики посиленої цитотоксичності проти людського глобуліну (AHG-CDC) та В-клітинного крос-матчу. Про методи тканинного типування та протоколи підготовки можна дізнатися в попередній статті. 

Проведення серологічного Т-клітинного крос-матчу з використанням методики посиленої цитотоксичності проти людського глобуліну (AHG-CDC) 

Реагенти та обладнання:

• Шприци Hamilton на 1 мкл та 5 мкл
• Камера Горяєва
• Пробірки на 1.5 мл
• Фазово-контрастний інвертований мікроскоп із об’єктивом 40x
• Центрифуга
• Терасакі 72-лункові планшети
• Контрольні сироватки (Anti-lymphocyte serum, Anti-T cell serum, Normal human serum)
• 0,4% Трипановий синій 
• Eosin Y, формальдегід, Phenol red, 1N potassium hydroxide (KOH) або sodium hydroxide (NaOH)
• Phosphate Buffered Saline (PBS) без Са та Мg
• McCoy’s Media або RPMI з 0.5% heat inactivated FСS (HIFCS)
• Кролячий комплімент Клас 1 (Кат # CABC-1D)
• Goat IGG Anti-Human Kappa (Кат # AHG1)
• Мінеральне масло

Покрокова процедура:

1. Приготувати планшет для скринінгу сироватки, додавши по 1 мкл кожної досліджуваної сироватки та сироватки негативного та позитивного контролю у відповідні лунки 72-лункового планшету Терасакі та покрити сироватки 5 мкл мінеральної олії для запобігання випаровуванню.
2. Довести концентрацію Т-клітин (отриманних з Dynabeads HLA CLASS I) до 2-3 мільйонів/мл за допомогою поживного середовища та порахувати на життєздатність (має бути 90% та вище). Життєздатність розраховується як кількість життєздатних клітин поділене на загальне число клітин в камері Горяєва. Клітини, пофарбовані 0,4% трипановим синім (1:1 з клітинною суспензією), вважаються нежиттєздатними.
3. Додайте 1 мкл добре перемішаної суспензії клітин до кожної досліджуваної лунки сироватки та контролів. Капайте зверху на олію, обережно, щоб не торкнутися сироватки кінчиком голки для уникнення перехресного забруднення.
4. Перевірте наявність контакту сироватки з клітинами у кожній лунці та ретельно перемішайте клітини та сироватки змішувачем або голкою шприца, якщо компоненти розділені. Промивайте голку між сироватками. Інкубуйте при кімнатній температурі (20-25º C) протягом 30 хвилин.
5. Розморозити AHG (зберігається в нерозведеному вигляді) та кролячий комплімент (C’). Приготуйте робоче розведення AHG з RPMI 1640. Відновити комплімент додавши 1 мл стерильної води при температурі 2-5° C. Зберігати при температурі 2–5 °C до використання. Невикористаний комплімент повинен бути розподілений на аліквоти і зберігатися при -20 °C або нижче. 
6. Після інкубації додайте 5 мкл середовища (RPMI 1640) у кожну лунку. Переконайтеся, що промивна рідина потрапляє під масло, і добре перемішати.
7. Помістіть планшети в центрифугу; прискорити центрифугу до 1000 об/хв; потримайте 10 секунд і вимкнути.
8. Обережно злити супернатант, повторити промивку 2 рази.
9. Додайте 5 мкл мінеральної олії в кожну лунку.
10. Додайте 5 мкл суміші AHG/C’ у кожну тестову лунку.
11. Інкубувати протягом 60 хвилин при 20-25ºC.
12. Фарбування:

0,4% Трипановий синій

• Видаліть надлишок комплементу піпетуванням або струшуванням планшету швидким рухом зап’ястя, обережно, щоб не витрусити клітини.
• Додайте до кожної лунки 0,4% розчину трипанового синього, обережно, щоб не порушити клітини. Залишити на 5-10 хв, потім видалити надлишок барвника, як на попередньому кроці.

5% Еозин-Y (натрієва основа) та фіксація формальдегідом

• Приготування 5% водного розчину: перед кожним використанням фільтрувати; зберігати при кімнатній температурі. Формальдегід (37% формалін): додати 2 мл 5% розчину фенол-червоного кольору до 500 мл формальдегіду; додати 10N KOH для доведення рН до 7,2-7,4; зберігати при кімнатній температурі та фільтрувати перед кожним використанням.
• Зупиніть і зафіксуйте реакцію, додавши 5 мкл 5% еозину в кожну лунку, а потім через 2 хвилини додайте 5 мкл розчину формальдегіду. Дайте клітинам осісти протягом 10 хвилин.

Читайте також: Частина 1. Методи тканинного типування. Протоколи підготовки.

Проведення серологічного В-клітинного крос-матчу

Реагенти та обладнання:

• Шприци Hamilton на 1 мкл та 5 мкл
• Камера Горяєва
• Пробірки на 1.5 мл
• Фазово-контрастний інвертований мікроскоп із об’єктивом 40x
• Центрифуга
• Терасакі 72-лункові планшети
• Контрольні сироватки (Anti-lymphocyte serum, Normal human serum)
• 0,4% Трипановий синій 
• Eosin Y, формальдегід, Phenol red, 1N potassium hydroxide (KOH) або sodium hydroxide (NaOH)
• Phosphate Buffered Saline (PBS) без Са та Мg
• McCoy’s Media або RPMI з 0.5% heat inactivated FСS (HIFCS)
• Кролячий комплімент Клас 2 (Кат # CDR-1D)
• Мінеральне масло

Покрокова процедура:

1. Приготувати планшет для скринінгу сироватки, додавши по 1 мкл кожної досліджуваної сироватки та сироватки негативного та позитивного контролю у відповідні лунки 72-лункового планшету Терасакі та покрити сироватки 5 мкл мінеральної олії для запобігання випаровуванню.
2. Довести концентрацію В-клітин (отриманих з Dynabeads HLA CLASS IІ) до 3 мільйонів / мл за допомогою поживного середовища та порахувати на життєздатність (має бути 90% та вище). Життєздатність розраховується як кількість життєздатних клітин поділене на загальне число клітин в камері Горяєва. Клітини, пофарбовані 0,4% трипановим синім (1:1 з клітинною суспензією), вважаються нежиттєздатними.
3. Додайте 1 мкл добре перемішаної суспензії клітин до кожної досліджуваної лунки сироватки та контролів. Капайте зверху на олію, обережно, щоб не торкнутися сироватки кінчиком голки для уникнення перехресного забруднення.
4. Перевірте наявність контакту сироватки з клітинами у кожній лунці та ретельно перемішайте клітини та сироватки змішувачем або голкою шприца, якщо компоненти розділені. Промивайте голку між сироватками. Інкубуйте при кімнатній температурі (20-25º C) протягом 30 хвилин.
5. Після інкубації додайте 5 мкл C ’у кожну тестову лунку.
6. Інкубувати протягом 60 хвилин при 20-25ºC.
7. Фарбування:

0,4% Трипановий синій

• Видаліть надлишок комплементу піпетуванням або струшуванням планшету швидким рухом зап’ястя, обережно, щоб не витрусити клітини.
• Додайте до кожної лунки 0,4% розчину трипанового синього, обережно, щоб не порушити клітини. Залишити на 5-10 хв, потім видалити надлишок барвника, як на попередньому кроці.

5% Еозин-Y (натрієва основа) та фіксація формальдегідом

• Приготування 5% водного розчину: перед кожним використанням фільтрувати; зберігати при кімнатній температурі. Формальдегід (37% формалін): Додати 2 мл 5% розчину фенол-червоного кольору до 500 мл формальдегіду; додати 10N KOH для доведення рН до 7,2-7,4; зберігати при кімнатній температурі та фільтрувати перед кожним використанням.

Зупиніть і зафіксуйте реакцію, додавши 5 мкл 5% еозину в кожну лунку, а потім через 2 хвилини додайте 5 мкл розчину формальдегіду. Дайте клітинам осісти протягом 10 хвилин.

Т або В – лімфоцитарний крос-матч  (імуномагнітні частинки)

Реагенти та обладнання:

• Шприци Hamilton на 1 мкл та 5 мкл
• Пробірки на 1.5 мл
• Флуорисцентний інвертований мікроскоп
• Центрифуга
• Терасакі 72-лункові планшети
• Контрольні сироватки (Anti-lymphocyte serum, Anti-B cell serum, Anti-Т cell serum, Normal human serum)
• Phosphate Buffered Saline (PBS) без Са та Мg
• McCoy’s Media або RPMI з 0.5% heat inactivated FСS (HIFCS)
• Кролячий комплімент Клас 1 (Кат # CABC-1D)
• Кролячий комплімент Клас 2 (Кат # CDR-1D)
• Etidium Bromid та Сarboxyfluoroscein diacetate (CFDA). 

Гасіння фону – чорнило, гемоглобін

АБО готовий реагент FluoroQuench™ Acridine Orange/Ethidium Bromide

• Мінеральне масло

Покрокова процедура:

CFDA метод

1. Додати 5 мкл мінеральної олії в кожну лунку планшету Терасакі. Помістити 1 мкл кожної досліджуваної сироватки, а також сироваток негативного та позитивних контролів.
2. Зняти кришку та помістити пробірку з суспензією клітин отриманих з FluoroBeads®-Т або FluoroBeads®-В в магнітний сепаратор на 1 хвилину. Злити супернатант та ресуспендувати клітини (бідси) у PBS. Повторити двічі.
3. Додати 0,5 мл CFDA (робочий розчин, рН 5,5) і перемішати.
4. Інкубувати пробірку горизонтально в темряві протягом 10 хвилин при 20 ° C до 25 °C.
5. Повторити крок 2 вище. Ресуспендувати клітини в 0,5 мл середовища з 5% HIFCS.
6. Додати 1 мкл суспензії клітин у порожню лунку планшету Терасакі та перевірити кількість клітин за допомогою флуоресцентного мікроскопа. Довести концентрацію до 2 х 106 / мл (2000 клітин на лунку).
7. Перемішати суспензію клітин перевертаючи пробірку (не перемішувати піпетуванням з шприцом). Додати 1 мкл мічених CFDA клітин (бідсів) у кожну лунку планшету Терасакі. Переконайтесь, що клітини та сироватки змішались.
8. Інкубувати у темряві протягом 30 хвилин при 20 ° C до 25 ° C.
9. Додати 5 мкл кролячого АВС або DR комплементу у кожну лунку.
10. Інкубувати планшет у темряві протягом 1 години при 20 ° C до 25 ° C.
11. У кожну лунку додати 5 мкл одного з наступних інгредієнтів:

1. ЕB/ робочий розчин гемоглобіну або
2. EB / 1% робочий розчин чорнила

12. Планшети можна прочитати відразу, або їх можна зберегти у темряві при температурі від 20 ° до 25 ° C до 2 днів.

FQAE метод

1. Додати 5 мкл мінеральної олії в кожну лунку планшету Терасакі. Помістити 1 мкл кожної досліджуваної сироватки, а також сироваток негативного та позитивних контролів.
2. Додайте 1 мкл клітин (бідсів) у порожню лунку планшету Терасакі та додати 5 мкл реагенту FQAE.
3. Перевірити кількість клітин за допомогою флуоресцентного мікроскопа. Довести концентрацію до 2 х 106 / мл (2000 клітин на лунку).
4. Перемішати суспензію клітин перевертаючи пробірку (не перемішувати піпетуванням з шприцом). Додайте 1 мкл клітин (бідсів) у кожну лунку планшету Терасакі. Переконайтесь, що клітини та сироватки змішались.
5. Інкубувати у темряві протягом 30 хвилин при 20 ° C до 25 ° C.
6. Додати 5 мкл кролячого АВС або DR комплементу у кожну лунку.
7. Інкубувати планшет у темряві протягом 1 години при 20 ° C до 25 ° C.
8. У кожну лунку додайте 5 мкл FQAE.
9. Планшети можна прочитати відразу, або їх можна зберегти у темряві при температурі від 20 ° до 25 ° C до 2 днів.

Зчитування та інтерпретація результатів комплімент-залежного мікроцитотоксичного крос-матчу/CDC Crossmatch (ASHI Manual)

1. Робочий аркуш кожного планшету має включати ім’я пацієнта або донора, дату, ініціали операціоніста, що проводить випробування, тип кросс-матчу, температуру, яка використовується для тесту та відсоток життєздатності клітин.
2. Переконайтеся, що робочий аркуш планшету відповідає кожному тестовому планшету безпосередньо перед його аналізом у полі зору мікроскопа.
3. Зчитування планшету відбувається по-серпантину. (Прочитати вздовж ряду 1 [лунки A-F], потім назад вздовж ряду 2 [F-A] тощо)
4. Запишіть результати на правильному робочому бланку відповідно до наступної шкали та примітки:

Примітка: Зазвичай оцінку негативного контролю реєструють так, як вона інтерпретується в тесті, а всі інші оцінки записують із вирахуванням фону (тобто значення негативного контролю).

• Якщо значення дорівнює або менше негативного контролю, то операціоніст записує показання із вирахуванням фону або зазначає на аркуші відповідним чином, що фон вище за звичайний.
• Усі фактичні оцінки мають бути записані, якщо бали тестових реакції перевищують показники негативного контролю.

5. Інтерпретуйте результати наступним чином (див. ASHI Manual, “Interpretation of Crossmatch Results”):

1. Будь-яку позитивну реакцію, яка на 11% перевищує значення негативного контролю, слід інтерпретувати як ПОЗИТИВНИЙ КРОС-МАТЧ.
2. Негативну реакцію, еквівалентну або меншу ніж 11% від негативного контролю, слід інтерпретувати як НЕГАТИВНИЙ КРОС-МАТЧ.
3. Якщо контролі не реагують належним чином, повідомте про це керівника лабораторії:

• Бал негативного контролю повинен бути «2» або менше (життєздатність клітин більше 80%).
• Контроль ALS (анти-лімфоцитарний) повинен бути позитивним для Т і В-клітин з оцінкою «4» або більше.
• Контроль ABS (анти-В-лімфоциторний) повинен бути позитивним для В-клітин з оцінкою «4» або більше, а для Т-клітин – негативним.

Література 

1. Amy B Hahn; Geoffrey A Land; Rosemarie M Strothman; American Society for Histocompatibility and Immunogenetics. ASHI laboratory manual. American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, ©2000, 4rth ed.
2. Fuller TC, Fuller AA, Golden M, Rodey G. HLA alloantibodies and the mechanism of the antiglobulin-augmented lymphocytotoxicity procedure. Hum Immunol 56: 94-105, 1997.
3. One Lambda, Inc. Product Insert for Dynabeads™ HLA CLASS I and CLASS II, MAN0009978.
4. One Lambda, Inc. Product Insert for FluoroBeads®B, TDX-OLI-DMR-PS-0852, Rev 02.
5. One Lambda, Inc. Product Insert for FLUOROBEADS-T AND FLUOROBEADS-T DEVELOPER, TDX-OLI-DMR-PS-2907, Rev 02.
6. One Lambda, Inc. Product Insert for Goat IGG Anti-Human Kappa (Free and Bound Light Chains), TDX-OLI-DMR-PS-2448, Rev 03