Методы тканевого типирования: CDC кросс-матч и его практическое проведение в лабораторном сопровождении трансплантации. Часть 2

В данной статье подробно рассмотрена процедура практического проведения серологического Т-клеточного кросс-матча с использованием методики усиленной цитотоксичности против человеческого глобулина (AHG-CDC) и В-клеточного кросс-матча.  О методах тканевого типирования и протоколах подготовки можно узнать в предыдущей статье.

Проведение серологического Т-клеточного кросс-матча с использованием методики усиленной цитотоксичности против человеческого глобулина (AHG-CDC)

Реагенты и оборудование:

• Шприцы Hamilton на 1 мкл и 5 мкл
• Камера Горяева
• Пробирки на 1.5 мл
• Фазово-контрастный инвертированный микроскоп с объективом 40x
• Центрифуга
• Терасаки 72-луночные планшеты
• Контрольные сыворотки (Anti-lymphocyte serum, Anti-T cell serum, Normal human serum)
• 0,4% Трипановый синий
• Eosin Y, формальдегид, Phenol red, 1N potassium hydroxide (KOH) или sodium hydroxide (NaOH)
• Phosphate Buffered Saline (PBS) без Са и Мg
• McCoy’s Media или RPMI с 0.5% heat inactivated FСS (HIFCS)
• Кроличий комплимент Класс 1 (Кат # CABC-1D)
• Goat IGG Anti-Human Kappa (Кат # AHG1)
• Минеральное масло

Пошаговая процедура:

1. Приготовить планшет для скрининга сыворотки, добавив по 1 мкл каждой изучаемой сыворотки и сыворотки отрицательного и положительного контроля в соответствующие лунки 72-луночного планшета Терасаки и покрыть сыворотки 5 мкл минерального масла для предотвращения испарения.
2. Довести концентрацию Т-клеток (полученных из Dynabeads HLA CLASS I) до 2-3 миллионов/мл с помощью питательной среды и сосчитать на жизнеспособность (должно быть 90% и выше). Жизнеспособность рассчитывается как количество жизнеспособных клеток, разделенное на общее число клеток в камере Горяева. Клетки, окрашенные 0,4% трипановым синим (1:1 с клеточной суспензией), считаются нежизнеспособными.
3. Добавьте 1 мкл хорошо перемешанной суспензии клеток в каждую исследуемую лунку сыворотки и контролей. Капайте сверху на масло, осторожно, чтобы не коснуться сыворотки кончиком иглы во избежание перекрестного загрязнения.
4. Проверьте контакт сыворотки с клетками в каждой лунке и тщательно перемешайте клетки и сыворотки смесителем или иглой шприца, если компоненты разделены. Промывайте иглу между сыворотками. Инкубируйте при комнатной температуре (20-25º C) в течение 30 минут.
5. Разморозить AHG (хранится в неразбавленном виде) и кроличий комплимент (C’). Приготовьте рабочее разведение AHG из RPMI 1640. Восстановить комплимент добавив 1 мл стерильной воды при температуре 2-5 °C. Хранить при температуре 2-5 °C до использования. Неиспользованный комплимент должен быть распределен на аликвоты и храниться при –20°C или ниже.
6. После инкубации добавьте 5 мкл среды (RPMI 1640) в каждую лунку. Убедитесь, что промывная жидкость попадает под масло и хорошо перемешайте.
7. Поместите планшеты в центрифугу; ускорить центрифугу до 1000 об/мин; удерживайте 10 секунд и выключите.
8. Осторожно слить супернатант, повторить промывку 2 раза.
9. Добавьте 5 мкл минерального масла в каждую лунку.
10. Добавьте 5 мкл смеси AHG/C’ в каждую тестовую лунку.
11. Инкубировать в течение 60 минут при 20-25C.
12. Покраска:

 0,4% Трипановый синий

• Удалите избыток комплемента пипетированием или встряхиванием планшета быстрым движением запястья, осторожно, чтобы не вытряхнуть клетки.
• Добавьте к каждой лунке 0,4% раствора трипанового синего, осторожно, чтобы не нарушить клетки. Оставить на 5-10 мин, затем удалить избыток красителя, как на предыдущем шаге.

5% Эозин-Y (натриевая основа) и фиксация формальдегидом

• Приготовление 5% водного раствора: перед каждым использованием отфильтровывать; хранить при комнатной температуре. Формальдегид (37% формалин): добавить 2 мл 5% раствора фенол-красного цвета до 500 мл формальдегида; добавить 10N KOH для доведения рН до 7,2-7,4; хранить при комнатной температуре и отфильтровывать перед каждым использованием.
• Остановите и зафиксируйте реакцию, добавив 5 мкл 5% эозина в каждую лунку, а затем через 2 минуты добавьте 5 мкл раствора формальдегида. Дайте клеткам осесть в течение 10 минут.

Читайте также: Часть 1. Методы тканевого типирования. Протоколы подготовки.

Проведение серологического В-клеточного кросс-матча

Реагенты и оборудование:

• Шприцы Hamilton на 1 мкл и 5 мкл
• Камера Горяева
• Пробирки на 1.5 мл
• Фазово-контрастный инвертированный микроскоп с объективом 40x
• Центрифуга
• Терасаки 72-луночные планшеты
• Контрольные сыворотки (Anti-lymphocyte serum, Normal human serum)
• 0,4% Трипановый синий
• Eosin Y, формальдегид, Phenol red, 1N potassium hydroxide (KOH) или sodium hydroxide (NaOH)
• Phosphate Buffered Saline (PBS) без Са и Мg
• McCoy’s Media или RPMI с 0.5% heat inactivated FСS (HIFCS)
• Кроличий комплимент Класс 2 (Кат # CDR-1D)
• Минеральное масло

Пошаговая процедура:

1. Приготовить планшет для скрининга сыворотки, добавив по 1 мкл каждой изучаемой сыворотки и сыворотки отрицательного и положительного контроля в соответствующие лунки 72-луночного планшета Терасаки и покрыть сыворотки 5 мкл минерального масла для предотвращения испарения.
2. Довести концентрацию В-клеток (полученных из Dynabeads HLA CLASS II) до 3 миллионов/мл с помощью питательной среды и сосчитать на жизнеспособность (должно быть 90% и выше). Жизнеспособность рассчитывается как количество жизнеспособных клеток, разделенное на общее число клеток в камере Горяева. Клетки, окрашенные 0,4% трипановым синим (1:1 с клеточной суспензией), считаются нежизнеспособными.
3. Добавьте 1 мкл хорошо перемешанной суспензии клеток в каждую исследуемую лунку сыворотки и контролей. Капайте сверху на масло, осторожно, чтобы не коснуться сыворотки кончиком иглы во избежание перекрестного загрязнения.
4. Проверьте контакт сыворотки с клетками в каждой лунке и тщательно перемешайте клетки и сыворотки смесителем или иглой шприца, если компоненты разделены. Промывайте иглу между сыворотками. Инкубируйте при комнатной температуре (20-25ºC) в течение 30 минут.
5. После инкубации добавьте 5 мкл C’ в каждую тестовую лунку.
6. Инкубировать в течение 60 минут при 20-25C.
7. Покраска:

0,4% Трипановый синий

• Удалите избыток комплимента пипетированием или встряхиванием планшета быстрым движением запястья, осторожно, чтобы не вытряхнуть клетки.
• Добавьте к каждой лунке 0,4% раствора трипанового синего, осторожно, чтобы не нарушить клетки. Оставить на 5-10 мин, затем удалить избыток красителя, как на предыдущем шаге.

5% Эозин-Y (натриевая основа) и фиксация формальдегидом

• Приготовление 5% водного раствора: перед каждым использованием отфильтровывать; хранить при комнатной температуре. Формальдегид (37% формалин): добавить 2 мл 5% раствора фенол-красного цвета до 500 мл формальдегида; добавить 10N KOH для доведения рН до 7,2-7,4; хранить при комнатной температуре и отфильтровывать перед каждым использованием.
• Остановите и зафиксируйте реакцию, добавив 5 мкл 5% эозина в каждую лунку, затем через 2 минуты добавьте 5 мкл раствора формальдегида. Дайте клеткам осесть в течение 10 минут.

Т или В – лимфоцитарный кросс-матч (иммуномагнитные частицы)

Реагенты и оборудование:

• Шприцы Hamilton на 1 мкл и 5 мкл
• Пробирки на 1.5 мл
• Флуоресцентный инвертированный микроскоп
• Центрифуга
• Терасаки 72-луночные планшеты
• Контрольные сыворотки (Anti-lymphocyte serum, Anti-B cell serum, Anti-T cell serum, Normal human serum)
• Phosphate Buffered Saline (PBS) без Са и Мg
• McCoy’s Media или RPMI с 0.5% heat inactivated FСS (HIFCS)
• Кроличий комплимент Класс 1 (Кат # CABC-1D)
• Кроличийкомплимент Класс 2 (Кат # CDR-1D)
• Etidium Bromid и Сarboxyfluoroscein diacetate (CFDA).

Тушение фона – чернила, гемоглобин

ИЛИ готовый реагент FluoroQuench™ Acridine Orange/Ethidium Bromide

• Минеральное масло

Пошаговая процедура:

CFDA метод

1. Добавить 5 мкл минерального масла в каждую лунку планшета Терасаки. Поместить 1 мкл каждой изучаемой сыворотки, а также сывороток отрицательного и положительных контролей.
2. Снять крышку и поместить пробирку с суспензией клеток, полученных из FluoroBeads®-Т или FluoroBeads®-В в магнитный сепаратор на 1 минуту. Слить супернатант и ресуспендировать клетки (бидсы) в PBS. Повторить дважды.
3. Добавить 0,5 мл CFDA (рабочий раствор, рН 5,5) и перемешать.
4. Инкубировать пробирку горизонтально в темноте в течение 10 минут при 20°C до 25°C.
5. Повторите шаг 2 выше. Ресуспендировали клетки в 0,5 мл среды с 5% HIFCS.
6. Добавить 1 мкл суспензии клеток в пустую лунку планшета Терасаки и проверить количество клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Довести концентрацию до 2 х 106/мл (2000 клеток в лунку).
7. Перемешать суспензию клеток, переворачивая пробирку (не перемешивать пипетированием со шприцем). Добавить 1 мкл меченых CFDA клеток (бидсов) в каждую лунку планшета Терасаки. Убедитесь, что клетки и сыворотки смешались.
8. Инкубировать в темноте в течение 30 минут при 20°C до 25°C.
9. Добавить 5 мкл кроличьего АВС или DR комплемента в каждую лунку.
10. Инкубировать планшет в темноте в течение 1 часа при 20°C до 25°C.
11. В каждую лунку добавить 5 мкл одного из следующих ингредиентов:

1. ЕB/ рабочий раствор гемоглобина или
2. EB/1% рабочий раствор чернил

12. Планшеты можно прочесть сразу, или их можно сохранить в темноте при температуре от 20° до 25°C до 2 дней.

FQAE метод

1. Добавить 5 мкл минерального масла в каждую лунку планшета Терасаки. Поместить 1 мкл каждой изучаемой сыворотки, а также сывороток отрицательного и положительных контролей.
2. Добавьте 1 мкл клеток (бидсов) в пустую лунку планшета Терасаки и добавить 5 мкл реагента FQAE.
3. Проверьте количество клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Довести концентрацию до 2 х 106/мл (2000 клеток в лунку).
4. Перемешать суспензию клеток, переворачивая пробирку (не перемешивать пипетированием со шприцем). Добавьте 1 мкл клеток (бидсов) в каждую лунку планшета Терасаки. Убедитесь, что клетки и сыворотки смешались.
5. Инкубировать в темноте в течение 30 минут при 20°C до 25°C.
6. Добавить 5 мкл кроличьего АВС или DR комплемента в каждую лунку.
7. Инкубировать планшет в темноте в течение 1 часа при 20°C до 25°C.
8. В каждую лунку добавьте 5 мкл FQAE.
9. Планшеты можно прочесть сразу, или их можно сохранить в темноте при температуре от 20° до 25°C до 2 дней.

Считывание и интерпретация результатов комплемент-зависимого микроцитотоксического кросс-матча/CDC Crossmatch (ASHI Manual) 

1. Рабочий лист каждого планшета должен включать имя пациента или донора, дату, инициалы проводящего испытания операциониста, тип кросс-матча, температуру, используемую для теста и процент жизнеспособности клеток.
2. Убедитесь, что рабочий лист планшета соответствует каждому тестовому планшету перед его анализом в поле зрения микроскопа.
3. Считывание планшета происходит по серпантину. (Прочитать вдоль ряда 1 [лунки A-F], затем вдоль ряда 2 [F-A] и т.д.)
4. Запишите результаты на правильном рабочем бланке в соответствии со следующей шкалой и примечанием:

Примечание: Обычно оценку отрицательного контроля регистрируют так, как она интерпретируется в тесте, а остальные оценки записывают с вычетом фона (т.е. значение отрицательного контроля).

• Если значение равно или меньше отрицательного контроля, то операционист записывает показания с вычетом фона или указывает на листе соответствующим образом, что фон выше обычного.
• Все фактические оценки должны быть записаны, если баллы тестовых реакций превышают показатели отрицательного контроля.

5. Интерпретируйте результаты следующим образом (см. ASHI Manual, “Interpretation of Crossmatch Results”):

1. Любую положительную реакцию, которая на 11% превышает значение отрицательного контроля, следует интерпретировать как ПОЗИТИВНЫЙ КРОСС-МАТЧ.
2. Отрицательную реакцию, эквивалентную или менее 11% от отрицательного контроля, следует интерпретировать как отрицательный КРОСС-МАТЧ.
3. Если контроли не реагируют должным образом, сообщите об этом руководителю лаборатории:

• Балл отрицательного контроля должен быть «2» или меньше (жизнеспособность клеток больше 80%).

• Контроль ALS (антилимфоцитарный) должен быть положительным для Т и В-клеток с оценкой «4» или более.

• Контроль ABS (анти-В-лимфоциторный) должен быть положительным для В-клеток с оценкой «4» или более, а для Т-клеток – отрицательным.

Литература

1. Amy B Hahn; Geoffrey A Land; Rosemarie M Strothman; American Society for Histocompatibility and Immunogenetics. ASHI laboratory manual. American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, ©2000, 4rth ed.
2. Fuller TC, Fuller AA, Golden M, Rodey G. HLA alloantibodies and mechanism of antiglobulin-augmented lymphocytotoxicity procedure. Hum Immunol 56: 94-105, 1997.
3. One Lambda, Inc. Product Insert for Dynabeads™ HLA CLASS I и CLASS II, MAN0009978.
4. One Lambda, Inc. Product Insert for FluoroBeads®B, TDX-OLI-DMR-PS-0852, Rev 02.
5. One Lambda, Inc. Product Insert для FLUOROBEADS-T AND FLUOROBEADS-T DEVELOPER, TDX-OLI-DMR-PS-2907, Rev 02.
6. One Lambda, Inc. Product Insert for Goat IGG Anti-Human Kappa (Free and Bound Light Chains), TDR-OLI-DMR-PS-2448, Rev 03.