Як працює секвенування нового покоління (NGS) на прикладі технології Ion Torrent

Секвенування нового покоління (NGS) – це високопродуктивний метод, який досягається шляхом секвенування клонально ампліфікованих ДНК-матриць у масовому масштабі. Метод має широке застосування та відкриває науковцям нові можливості у вивченні геномів, транскриптомів чи екземів будь-якого організму. Висока продуктивність, швидкість та масштабованість технології NGS дозволяють досліджувати біологічні системи на новому рівні.

Особливого значення метод секвенування нового покоління набув у вивченні геному вірусу SARS-CoV-2 та розумінні мутацій, що у ньому відбуваються. Завдяки NGS вчені отримали можливість відстежувати зміни в геномі збудника СОVID-19, які відбуваються постійно протягом пандемії та призводять до появи нових варіантів вірусу – Альфа, Каппа, Дельта, Дельта + та інших. На відміну від ПЛР-тестів, що встановлюють факт наявності чи відсутності в організмі людини коронавірусу шляхом визначення його генетичного матеріалу, геномне секвенування дозволяє не лише виявити вірус, а й ідентифікувати конкретний варіант, а також нові (раніше не описані) зміни генів вірусу. Крім того, ця технологія та обладнання дозволяють працювати і з іншими патогенами (гельмінтами, мікроорганізмами та вірусами) на геномному рівні.

У жовтні 2021 року технологію взяв на озброєння  Центр громадського здоров’я (ЦОЗ) України для виявлення мутацій у геномі вірусу SARS-CoV-2 та ідентифікації його варіантів, які переважають серед населення країни. У лабораторії ЦОЗ встановлено обладнання для роботи з технологією NGS, розроблене партнером “АЛТ Україна” – компанією Thermo Fisher Scientific. Розповідаємо більше про технологію та обладнання.

Секвенування нового покоління Ion Torrent грунтується на виявленні іонів водню, які вивільняються в ході полімеризації ДНК та приєднання кожної наступної основи (однієї з чотирьох літер: А, Т, Г, Ц). При цьому відбувається фіксація зміни pH за допомогою напівпровідникових чіпів. При цьому одночасно фіксуються мільйони таких змін, щоб визначити послідовність кожного фрагмента, буква за буквою.

Напівпровідниковий підхід, на відміну від оптики або модифікованих нуклеотидів, що використовуються в інших технологіях NGS, допомагає лабораторії реалізувати швидкий і простий робочий процес, відповідно до дослідницьких потреб у різних додатках.

Схема робочого процесу NGS

Крок 1. Створення бібліотек

Бібліотеки для секвенування створюються з ДНК (або кДНК) відповідних зразків, яка перетворюється на відносно короткі дволанцюгові фрагменти (100–800 п.н.). Отримані фрагменти ДНК з’єднують із специфічними для технології послідовностями адаптерів, утворюючи бібліотеку фрагментів. Ці адаптери мають унікальний молекулярний “штрих-код”, тому кожен зразок може бути позначений унікальною послідовністю ДНК. Це дозволяє одночасно змішувати та секвенувати декілька зразків. Цей підхід, званий «мультиплексуванням», значно економить час і гроші під час проведення досліджень із використанням секвенування.

Крок 2. Клональна ампліфікація

Перед секвенуванням бібліотеку ДНК необхідно прикріпити до твердої поверхні і ампліфікувати клонально, щоб збільшити сигнал, який повинен бути виявлений від кожної мішені під час секвенування. При цьому кожна унікальна молекула ДНК у бібліотеці зв’язується з поверхнею кульки або проточного осередку та ампліфікується за допомогою ПЛР для створення набору ідентичних клонів.

Крок 3. Секвенування

Далі створені бібліотеки ДНК секвенуються під час використання геномних секвенаторів. Хоча кожна технологія NGS унікальна, більшість із них використовують «секвенування шляхом синтезу», зчитуючи окремі підстави в міру їхнього додавання вздовж полімеризованого ланцюга. Це цикл із загальними етапами: синтез основи ДНК на одноланцюгової ДНК з подальшим виявленням вбудованої основи та подальшим видаленням реагентів для перезапуску циклу. На кожному з циклів прилад фіксує наявність (літера приєдналася) або відсутність (не приєдналася) зміни pH, знаючи який із чотирьох нуклеотидів був у складі реагентів на цьому циклі.

Крок 4. Аналіз даних.

Кожен експеримент NGS генерує великі обсяги складних даних, що складаються з коротких зчитувань ДНК. Хоча кожна технологічна платформа має свої власні алгоритми та інструменти аналізу даних, загалом вони використовують схожий «конвеєр» аналізу та використовують загальні метрики для оцінки якості наборів даних NGS.

Дослідження раку

• Розробка лікарських препаратів
• Клінічні дослідження за допомогою рідинної біопсії
• Імуноонкологія
• Цільове секвенування для онкологічних досліджень

Комплексне дослідження хвороб

• Аналіз експресії генів
• Епігенетика та аналіз метилювання
• Дослідження мікробіома
• Імунна система
• Секвенування малих РНК та міРНК
• Цільове секвенування ДНК та РНК
• Транскриптом
• Клінічний екзом

Інфекційні хвороби та епідеміологія

• Секвенування вірусів та бактерій
• Метагеноміка
• Типування вірусів та бактерій

Репродуктивне здоров’я

• Розширений скринінг носійства (ECS)
• Передімплантаційний генетичний скринінг
• Неінвазивний пренатальний скринінг

Ідентифікація особи людини (HID)

• Цільове секвенування для судово-медичного аналізу ДНК
• Визначення батьківства
• Секвенування мтДНК

Агрігеноміка

• Цільове генотипування рослин та тварин

HLA-типування

• Генотипування на основі NGS

Повногеномне секвенування (WGS) – це найбільш повний метод, який дозволяє проводити поглиблений аналіз цілих геномів, включаючи екзони, області, що не кодують, і структурні варіанти. WGS не вимагає попереднього знання аналізованої послідовності геному, тому це найкращий метод для виявлення нових генетичних варіацій, пов’язаних із захворюваннями, складанням геному De novo, мікробним секвенуванням і низькочастотним секвенуванням геному для визначення кількості копій / анеуплоїдій.

На сьогодні вкрай актуальним залишається секвенування всього геному людини. Однак, при цьому, залишаються певні складнощі, пов’язані з аналізом даних. Існуючі бази даних є ані повними, ані точними. В результаті, для багатьох дослідницьких лабораторій вартість секвенування всього геному людини, її біоінформатичний аналіз, зберігання великого обсягу даних та ін. є досі непідйомними. Щоб вирішити цю проблему, багато вчених використовують цільові підходи до секвенування, такі як аналіз екзома, секвенування груп генів, використання панелей для конкретних регіонів, щоб покращити охоплення послідовностей та знизити загальні витрати на робочий процес секвенування.

Технологія Ion AmpliSeq

Компанія Thermo Fisher Scientific розробила вдосконалене збагачення ампліконів за допомогою технології Ion AmpliSeq. Унікальною особливістю цієї технології є можливість мультиплексування до 24 000 пар праймерів ПЛР в одній реакції, що дозволяє вченим секвенувати сотні генів з декількох зразків за цикл секвенування зі швидким часом виконання і низькою вартістю.

Ion AmpliSeq

Мікробіом – це складна екосистема, яка унікальна для кожної людини, оскільки вона змінюється та адаптується через різні навантаження навколишнього середовища, з якими людина стикається протягом усього свого життя. Вчені використовують NGS, щоб зрозуміти генетичний склад мікробіома та визначити, які мікроби можуть бути корисними, а які шкідливі для здоров’я. Цей NGS аналіз тепер включаються до клінічних досліджень, і вони значно впливають на майбутнє персоналізованої медицини. У міру просування вперед можна легко уявити використання аналізу мікробіома за допомогою NGS для визначення біомаркерів і стратифікації популяцій пацієнтів, що може допомогти поліпшити терапевтичні результати в майбутньому.

Секвенування нового покоління (NGS) значно розширило наше розуміння біології раку та зробило революцію у вивченні та лікуванні раку. Дослідження у галузі геноміки виявили значну генетичну гетерогенність навіть серед видів раку, які раніше вважалися ідентичними. Відкриття цих унікальних молекулярних «сигнатур» додало новий рівень складності у розробку потенційних методів лікування раку та стимулювало зростання точної медицини. Ці результати можуть призвести до майбутньої рекласифікації типів пухлин на основі молекулярних профілів та допомогти у виборі лікування на основі геномних біомаркерів. Вони привели до створення Атласу геному раку (TCGA), Бази даних про молекулярні зміни у різних типів раку, Загального атласу раку, Довідкової бібліотеки ключових публікацій про моделі походження ракових клітин та ін.

При виборі найбільш підходящого підходу до проекту секвенування генів необхідно враховувати безліч факторів. WGS – дуже потужний інструмент, але вартість такого підходу досі висока для масового використання. Цільовий підхід часто є більш придатною та рентабельною альтернативою, особливо для діагностичних та конкретних клінічних досліджень. У міру того, як наші знання про генетику, пов’язану з хворобами, примножуються, потреба у використанні геномного секвенування все більше зростає, і стає затребуваною. Більш того, персональні генетичні панелі для методу NGS стануть кроком уперед, знижуючи витрати та аналіз даних.

Далі буде…