Как работает секвенирование нового поколения (NGS) на примере технологии Ion Torrent.

Секвенирование нового поколения (NGS) – это высокопроизводительный метод, достигаемый путем секвенирования клонально амплифицированных ДНК-матриц в массовом масштабе. Метод имеет широкое применение и открывает исследователям новые возможности в изучении геномов, транскриптомов или экзомов любого организма. Высокая производительность, скорость и масштабируемость технологии NGS позволяют исследовать биологические системы на новом уровне. 

Особое значение метод секвенирования нового поколения приобрел в изучении генома вируса SARS-CoV-2 и понимании мутаций, которые в нем происходят. Благодаря NGS ученые получили возможность отслеживать изменения в геноме возбудителя СОVID-19, которые происходят постоянно в течение пандемии и приводят к появлению новых вариантов вируса – Альфа, Каппа, Дельта, Дельта +и других. В отличие от ПЦР-тестов, устанавливающих факт наличия или отсутствия в организме человека коронавируса путем определения его генетического материала, геномное секвенирование позволяет не только выявить вирус, но и идентифицировать конкретный вариант, а также новые (ранее не описанные) изменения в генах вируса. Кроме того, эта технология и оборудование позволяют работать и с другими патогенами (гельминтами, микроорганизмами и вирусами) на геномном уровне.

В октябре 2021 года технологию взял на вооружение Центр общественного здоровья (ЦОЗ) Украины для выявления мутаций в геноме вируса SARS-CoV-2 и идентификации его вариантов, преобладающих среди населения страны. В лаборатории ЦОЗ установлено оборудование для работы с технологией NGS, разработанное партнером “АЛТ Украина” – компанией Thermo Fisher Scientific. Рассказываем больше о технологии и оборудовании. 

Секвенирование нового поколения Ion Torrent основано на обнаружении ионов водорода, которые высвобождаются в ходе полимеризации ДНК и присоединении каждого следующего основания (одной из четырех букв: А, Т, Г, Ц). При этом происходит фиксация изменения pH с помощью полупроводниковых чипов. При этом одновременно фиксируются миллионы таких изменений, чтобы определить последовательность каждого фрагмента, буква за буквой. 

Полупроводниковый подход, в отличие от оптики или модифицированных нуклеотидов, используемых в других технологиях NGS, помогает лаборатории реализовать быстрый и простой рабочий процесс, в соответствии с исследовательскими потребностями в различных приложениях.

Шаг 1. Создание библиотек

Библиотеки для секвенирования создаются из ДНК (или кДНК) соответствующих образцов, которая преобразуется в относительно короткие двухцепочечные фрагменты (100–800 п.н.). Полученные фрагменты ДНК соединяют со специфическими для технологии последовательностями адаптеров, образуя библиотеку фрагментов. Эти адаптеры имеют уникальный молекулярный «штрих-код», поэтому каждый образец может быть помечен уникальной последовательностью ДНК. Это позволяет одновременно смешивать и секвенировать несколько образцов. Данный подход, называемый «мультиплексированием», значительно экономит время и деньги при проведении исследований с использованием секвенирования. 

Шаг 2. Клональная амплификация

Перед секвенированием библиотеку ДНК необходимо прикрепить к твердой поверхности и клонально амплифицировать, чтобы увеличить сигнал, который должен быть обнаружен от каждой мишени во время секвенирования. При этом каждая уникальная молекула ДНК в библиотеке связывается с поверхностью шарика или проточной ячейки и амплифицируется с помощью ПЦР для создания набора идентичных клонов. 

Шаг 3. Секвенирование

Далее созданные библиотеки ДНК секвенируются при использовании геномных секвенаторов. Хотя каждая технология NGS уникальна, большинство из них используют «секвенирование путем синтеза», считывая отдельные основания по мере их прибавления вдоль полимеризованной цепи. Это цикл с общими этапами: синтез основания ДНК на одноцепочечной ДНК с последующим обнаружением встроенного основания и последующим удалением реагентов для перезапуска цикла. На каждом из циклов прибор фиксирует наличие (буква присоединилась) или отсутствие (не присоединилась) изменения pH, зная какой из четырех нуклеотидов был в составе реагентов на этом цикле.

Шаг 4. Анализ данных.

Каждый эксперимент NGS генерирует большие объемы сложных данных, состоящих из коротких считываний ДНК. Хотя каждая технологическая платформа имеет свои собственные алгоритмы и инструменты анализа данных, в целом они используют схожий «конвейер» анализа и используют общие метрики для оценки качества наборов данных NGS.

Исследование рака

•     Разработка лекарственных препаратов
•     Клинические исследования при помощи жидкостной биопсии
•     Иммуноонкология
•     Целевое секвенирование для онкологических исследований

Комплексное исследование болезней

•     Анализ экспрессии генов
•     Эпигенетика и анализ метилирования
•     Исследование микробиома
•     Иммунная система
•     Секвенирование малых РНК и миРНК
•     Целевое секвенирование ДНК и РНК
•     Транскриптом
•     Клинический экзом

Инфекционные болезни и эпидемиология

•     Секвенирование вирусов и бактерий 
•     Метагеномика
•     Типирование вирусов и бактерий

Репродуктивное здоровье

•     Расширенный скрининг носительства (ECS)
•     Предимплантационный генетический скрининг
•     Неинвазивный пренатальный скрининг

Идентификация личности человека (HID)

•     Целевое секвенирование для судебно-медицинского анализа ДНК
•     Определение отцовства
•     Секвенирование мтДНК

Агригеномика

•     Целевое генотипирование растений и животных 

HLA-типирование

•     Генотипирование на основе NGS

Полногеномное секвенирование (WGS) – это наиболее полный метод, который позволяет проводить углубленный анализ целых геномов, включая экзоны, некодирующие области и структурные варианты. WGS не требует предварительного знания анализируемой последовательности генома, поэтому это лучший метод для обнаружения новых генетических вариаций, связанных с заболеваниями, сборкой генома De novo, микробным секвенированием и низкочастотным секвенированием генома для определения числа копий / анеуплоидий.

На сегодняшний день крайне актуальным остается секвенирование всего генома человека. Однако при этом остаются определенные сложности, связанные с анализом полученных данных. Существующие базы данных не являются ни полными, ни точными. В результате, для многих исследовательских лабораторий стоимость секвенирования всего генома человека, его биоинформатический анализ, хранение большого объема данных и др., являются до сих пор не подъемными. Чтобы решить эту проблему, многие исследователи используют целевые подходы к секвенированию, такие как анализ экзома, секвенирование групп генов, использование панелей для конкретных регионов, чтобы улучшить охват последовательностей и снизить общие затраты на рабочий процесс секвенирования.

Технология Ion AmpliSeq

Компания Thermo Fisher Scientific разработала усовершенствованное обогащение ампликонов с помощью технологии Ion AmpliSeq. Уникальной особенностью этой технологии является возможность мультиплексирования до 24 000 пар праймеров ПЦР в одной реакции, что позволяет исследователям секвенировать сотни генов из нескольких образцов за один цикл секвенирования с быстрым временем выполнения и низкой стоимостью. 

Ion AmpliSeq

Микробиом – это сложная экосистема, которая уникальна для каждого человека, поскольку она изменяется и адаптируется из-за различных нагрузок окружающей среды, с которыми человек сталкивается на протяжении всей своей жизни. Исследователи используют NGS, чтобы понять генетический состав микробиома и определить, какие микробы могут быть полезны, а какие вредны для здоровья. Этот NGS анализ теперь включаются в клинические исследования, и они значительно влияют на будущее персонализированной медицины. По мере продвижения вперед можно легко представить себе использование анализа микробиома с помощью NGS для определения биомаркеров и стратификации популяций пациентов, что может помочь улучшить терапевтические результаты в будущем.

Секвенирование нового поколения (NGS) значительно расширило наше понимание биологии рака и произвело революцию в изучении и лечении рака. Исследования в области геномики выявили значительную генетическую гетерогенность даже среди видов рака, которые ранее считались идентичными. Открытие этих уникальных молекулярных «сигнатур» добавило новый уровень сложности в разработку потенциальных методов лечения рака и стимулировало рост точной медицины. Эти результаты могут привести к будущей реклассификации типов опухолей на основе молекулярных профилей и помочь в выборе лечения на основе геномных биомаркеров. Они привели к созданию Атласа генома рака (TCGA), Базы данных о молекулярных изменениях у различных типов рака, Общего атласа рака, Справочной библиотеки ключевых публикаций о моделях происхождения раковых клеток и др.

При выборе наиболее подходящего подхода к проекту секвенирования генов необходимо учитывать множество факторов. WGS – очень мощный инструмент, но стоимость такого подхода до сих пор достаточна высока для массового использования. Целевой подход часто является более подходящей и рентабельной альтернативой, особенно для диагностических и конкретных клинических исследований. По мере того как наши знания о генетике, связанной с болезнями, приумножаются, потребность в использовании геномного секвенирования все больше и больше возрастает, и становится востребованной. Более того, персональные генетические панели для метода NGS станут шагом вперед, снижая затраты и анализ данных.

Продолжение следует…