Візуалізація мікроелементів за допомогою мас-спектрометрії з індуктивно-зв'язаною плазмою і системою лазерної абляції (МС-ІЗП-ЛА). Нові області застосування

Home Блог Візуалізація мікроелементів за допомогою мас-сп...

05.05.2021

Металоміка являє собою метод вивчення металобіохімії клітин організму в здоровому і хворобливому стані. В даному огляді ми спробували описати застосування мас-спектрометрії з індуктивно-зв’язаною плазмою і системою лазерної абляції (МС-ІЗП-ЛА) для візуалізації зображень, а також позначити її потенціал для отримання додаткових знань в області біоаналізу і металоміки.

Якісне та кількісне визначення мікроелементів є основним завданням мас-спектрометрії з індуктивно-зв’язаною плазмою (МС-ІЗП). У більшості випадків концентрація ряду елементів дозволяє використовувати даний метод для їх виявлення в зразку (часто він вимагає попередньої конденсації). Використання в поєднанні з МС-ІЗП методики лазерної абляції (ЛА) дозволяє отримати додаткові дані про ізотоп даного елемента в зразку, уникаючи при цьому трудомісткого і пов’язаного з ризиком забруднення процесу конденсації.

МС-ІЗП-ЛА також дозволяє аналізувати невеликі зразки з високолокалізованими відмінностями в концентраціях мікроелементів. Вищі чутливість і здатність усувати перешкоди за допомогою потрійних квадрупольних мас-спектрометрів, а також прискорені лазерні системи зі спеціалізованими абляційними осередками, які забезпечують швидке вимивання матеріалу з окремих лазерних імпульсів, проклали шлях для нових областей застосування МС-ІЗП-ЛА.

Програмне забезпечення приладу підтримує рекомбінацію даних, які були отримані в серії лінійних сканувань і охоплюють всю площу зразка. У поєднанні з інформацією про положення лазера в часі (зокрема, швидкості абляції, розміру фокальної плями і швидкості його руху) воно дозволяє відтворювати повну картину розподілу елементів в зразку. Особливо це корисно для дослідження біологічних зразків, для яких роль мікроелементів, які беруть участь в біологічних процесах, невідома.

Дана стаття пояснюється принцип дії МС-ІЗП-ЛА для візуалізації зображень, а також її потенціал для отримання додаткових знань в області біоаналізу і металоміки. Більш конкретно, метод буде використовуватися для дослідження впливу рівня забруднення навколишнього середовища на розподіл важких металів в мозку сторожових видів тварин в зонах з високим рівнем урбанізації.

Металоміка являє собою комплексний підхід для розуміння металобіохімії клітин організму в здоровому і хворобливому стані, який передбачає використання аналітичних інструментів для виявлення біологічної ролі металів як в просторі, так і в часі. Структура, каталіз і регуляторна функція кожного десятого білка в організмі людини залежить від наявності цинку, а для функціонування кожного другого з них потрібна присутність іонів даного металу. При цьому, як склад металу, так і його розподіл в клітинах і тканинах змінюються в ході фізіологічних і патофізіологічних процесів, від яких залежить поява, прогресування і лікування різних захворювань.

У кожній клітині можна знайти широкий спектр іонів металів (таких як натрій, калій, магній, кальцій, залізо, молібден, марганець, цинк і мідь) і неметалів (таких як хлорид, бромід, йодид і селен) в поєднанні з елементарними будівельними блоками біологічних молекул (такими як вуглець, кисень, азот, водень, сірка і фосфор). Таким чином, в залежності від функцій і розташування кожен тип клітин має унікальний іонний склад або «металом». Ці відомості можуть використовуватися для виявлення клітин з різними характеристиками:

високо проліферативних або злоякісних;
тих, які старіють на тлі різних хронічних захворювань (наприклад, слабоумство, діабет і рак);
хворих;
тих, які гинуть за регульованим або нерегульованим сценарієм.

До розвитку елементної біовізуалізації, яка досягаються за допомогою сполучених інструментів, таких як мас-спектрометр з індуктивно-зв’язаною плазмою і системою лазерної абляції, аналіз біологічних зразків в основному проводився за допомогою методів об’ємної кількісної оцінки і видоутворення. Однак на цей час очевидно, що дана інформація про склад біологічної тканини не дозволяє отримати її просторову візуалізацію, яка необхідна для глибокого вивчення ролі біологічних металів на клітинному і субклітинному рівнях.

Таким чином, поглиблення розуміння ролі біометалів у фундаментальній біології вимагає додаткової інформації про просторову локалізацію металів у тканинах. Значною мірою ця потреба була задоволена за допомогою ряду методів елементної біовізуалізації, включаючи (але не обмежуючись) синхротронну рентгенівську спектроскопію, вторинну іонну мас-спектрометрію (ВІМС) і МС-ІЗП-ЛА.

Матеріали та методи

Результатом аналізу методом МС-ІЗП-ЛА, який надає інформацію про розподіл елементів по двовимірній області зразка, є елементарні зображення або карти. Прикладом може служити поверхня зрізу біологічної тканини.

В ході аналізу лазерний промінь досягає поверхні зразка, який переміщається з певною постійною швидкістю. Часовий профіль лінійного сканування переводиться в профіль відстані. Збір декількох профілів зразка генерує 2D-зображення розподілу елементів ньому, послідовні 2D-карти зображень зразка складають 3D-карту, в якій інтенсивність сигналу прямо пропорційна концентрації. Щоб уникнути появи “артефактів”, робочий цикл приладу МС-ІЗП і швидкість переміщення лазера повинні бути синхронізовані. На мал. 1 представлений процес формування такого зображення.

Малюнок 1: Процедура отримання зображень з використанням МС-ІЗП-ЛА задля того, щоб уникнути потенційних артефактів.

Щоб отримати зображення даного зразка, необхідно вибрати відповідну область або область за допомогою додаткових методів візуалізації, таких як класична гістологія або мікроскопія незабарвлених зразків.

Зразки зазвичай надаються для аналізу у вигляді тонких зрізів на предметних склах мікроскопа. Залежно від типу зразка і необхідного рівня структурної схоронності зразки фіксуються в формаліні й укладаються в парафінові блоки (FFPE), або піддаються кріоконсервації з заливальної середовищем або без неї. У разі використання заливального середовища з метою уникнути високого фону необхідно вибрати матеріал з чистотою, яка підходить для конкретних мікроелементів.

Щоб збалансувати час аналізу і розмір отриманого зображення, необхідно оптимізувати розмір фокальної плями лазера. Цей параметр впливає на просторову роздільну здатність зображення, чутливість і швидкість аналізу. Великий розмір плями зменшує кількість матеріалу і, отже, дозволяє більшій кількості зразка досягати плазми, в той час як формування зображення досягається за коротшій час. Розміри плями 10-25 мкм може забезпечити розумне просторову роздільну здатність в залежності від типу тканини й поставлених дослідницьких завдань. Невеликий розмір плями (нижче 5 мкм) забезпечує чудову клітинну роздільну здатність, але вимагає високої чутливості для отримання співвідношення сигнал/шум (S/N) на рівні 10, який часто вважається мінімумом для кількісного дослідження. Субклітинна роздільна здатність (менше ніж 1 мкм) може бути отримана за допомогою підходу, який називається «надлишковою вибіркою».

Важливий також правильний вибір довжини хвилі лазера і газу-носія. Поєднання лазерної системи, яка має глибокий ультрафіолетовий (УФ) діапазон частот (наприклад, 193 нм) і гелію в якості газу-носія часто забезпечує максимальний результат. Ключові порівняльні дослідження описують робочі характеристики лазерних систем з діапазонами 193-213 і 193-266 нм.

Для отримання високоякісних зображень з достатнім контрастом для диференціації детальних структур важливо, щоб система МС-ІЗП, яка використовується для аналізу, могла забезпечувати високий рівень співвідношення сигнал/шум для досліджуваних елементів. Ці параметри включають не тільки чутливість виявлення, але і повне придушення перешкод. Виявлення особливо важливих для досліджень в області металоміки елементів, такі як залізо, марганець, мідь або цинк, може бути значно утруднено внаслідок поліатомних та інших взаємодій, зокрема:

На тлі зростання інтересу до розуміння метаболізму поживних речовин візуалізація додаткових елементів, таких як Se, P і S, також може бути значно ускладнена внаслідок поліатомних інтерференцій. Повне видалення цих інтерференцій в поєднанні з високою чутливістю виявлення часто досягається тільки за допомогою приладів МС-ІЗП на базі потрійних квадруполів. Типові умови для такого аналізу часто аналогічні умовам, наведеним у таблиці 1.

Результат

В наші дні з’являється все більше наукових свідчень, які пов’язують вплив забруднення повітря з негативним впливом на мозок – від когнітивних порушень в дитячому віці до зростання випадків деменції серед літніх людей. Дисгомеостаз металів був визнаний причиною ряду нейродегенеративних розладів. Також попередні дані пов’язують ці розлади з накопиченням металів в мозку собак і людей на територіях з сильним забрудненням.

При цьому, залишається неясним, як саме екзогенні метали накопичуються в мозку. Водночас деякі дані підтверджують поглинання багатих металами наночастинок нюховими нейронами в носі, які переносять їх в область нюхової цибулини мозку. Вважається, що надалі ці частинки можуть потрапляти в кровоносну систему, перетинаючи гематоенцефалічний бар’єр (ГЕБ). З урахуванням будь-яких шляхів поглинання, дослідження можуть представити зовсім невелику кількість даних про те, як саме пов’язані з частинками крові метали рухаються через паренхіму мозку і накопичуються вони в ній. Вивчення цих питань є складним завданням, яке пов’язано з необхідністю вирішення довгострокових накопичувальних процесів і обмеженим доступом до відповідного матеріалу в клінічних умовах.

Щоб виконати поставлене завдання було запропоновано дослідити концентрацію і розподіл металів в мозку так званих сторожових видів тварин, зокрема, їх популяцій з чітким контрастом впливу забруднювачів повітря, які пов’язані з міським трафіком. В якості об’єкта дослідження була обрана східна сіра білка, популяція якої контролюється в Лондоні і по всьому Сполученому Королівству. Цей вид надає собою унікальний ресурс для вивчення впливу забруднення навколишнього середовища на довгострокове накопичення металів в мозку.

У даній статті представлені попередні дані застосування МС-ІЗП-ЛА для вивчення елементарних патернів в мозку білок, які мешкають у Внутрішньому (високий рівень забруднення) і Зовнішньому (низький рівень забруднення) Лондоні. Після вибракування цілі мізки були витягнуті патологоанатомами Лондонського зоологічного товариства, а пізніше заморожені. Піддані заморожуванню зразки були піддані кріосекції і просушені на предметних склах 20 мм завтовшки, а потім досліджені приладом МС-ІЗП-ЛА з роздільною здатністю 40 мм для 63Cu, 57Fe і 208pb, з використанням 31P в якості морфологічного індикатора.

Репрезентативні зображення представлені на мал. 2. Ці дані є попередніми, але очевидним є явний контраст просторового розподілу обраних елементів між ділянками з низьким і високим рівнем забруднення (найбільш виразні на панелі С). Дані показують, що рівень Cu (часто пов’язаного з гальмівним пилом) підвищений в області нюхової цибулини тварин, які живуть у Внутрішньому Лондоні, тоді як Pb виявився підвищеним у тварин з Зовнішнього Лондона. Крім того, концентрація Cu, мабуть, була вищою в мозку білок з Внутрішнього Лондона. В цілому, Fe виявився вищим у зразку з Зовнішнього Лондона, що вказує на високу концентрацію в середній області мозку і чітких осередках високої інтенсивності, які розсіяні по всій паренхімі.

Малюнок 2. Лазерна абляція МС-ІЗП зображень осьового зрізу репрезентативних мізків білок з Внутрішнього (IL) і Зовнішнього (OL) Лондона з роздільною здатністю 40 мкм.

На панелі (а) показана концентрація 31р з OL, яка використовується в якості загального морфологічного показника, із зазначенням анатомічних областей мозку. * вказує на область, яка використовувалася для оптимізації методу абляції. На панелі (b) показані концентрації Cu, Fe і Pb. Панель (с) ілюструє комбінований розподіл елементів у зразках.

Як зазначалося вище, зараз ці зображення можуть вважатися лише свідченням того, що дана методика може надавати напівкількісні просторові дані про концентрацію металів в головному мозку. Дана робота може бути розширена в разі використання повнішого набору зразків і проведення традиційного аналізу розчинених зразків методом МС-ІЗП.

Зрештою, ці методи припускають, що елементні карти були пов’язані з класичним патогістологічним дослідженням тканин, що дозволить скорелювати інтенсивність розподілу металів в зразку з маркерами неврологічних захворювань, або механічними ушкодженнями, які дозволять пов’язати вплив забруднювачів повітря і розвитком захворювань. Для цього потрібне застосування інших багатомодельних аналітичних методів.

Висновок

МС-ІЗП-ЛА дозволяє проводити ізотопне картування ряду елементів в біологічних зразках з високою чутливістю і високою роздільною здатністю. Одним з основних недоліків даного методу є ризик руйнування зразка, що особливо стосується біологічних зразків. На відміну від застосування в геології, при якому нанометрові шари можуть бути видалені з поверхні твердих матеріалів, при елементній біовізуалізації МС-ІЗП-ЛА клітини й тканини повністю виділяються з їх опорних субстратів.

Розподільна здатність, яка в цей час може бути досягнута за допомогою МС-ІЗП-ЛА, особливо при надмірній вибірці, відкриває нові можливості для субклітинної візуалізації, яка як і раніше значною мірою залежить від розміру клітини й концентрації елементів в ній. Швидкий розвиток лазерного обладнання, яке здатне забезпечити менший розмір плями та, отже, картографування з вищою роздільною здатністю, тепер вимагає чутливості для дослідження невеликих зразків.

Залежно від типу МС-ІЗП (окремий квадруполь, потрійний квадруполь, time-of-flight-камера) чутливість може бути обмежувальним фактором для зображення ендогенних металів з високою роздільною здатністю (наприклад, 1 мкм), особливо при виявленні низьких концентрацій речовини.

Своєю чергою сила цього аналітичного методу (особливо стосовно металоміки) полягає в його включенні в кореляційні полімодельні процеси візуалізації та молекулярної-мас-спектрометрії, так що інформація, яка належить до хімічного середовища, пов’язаного з конкретними елементами, характеризується і може бути поміщена в контекст конкретних біологічних процесів і механізмів, які лежать в їх основі.