Протеоміка: дослідження білків за допомогою мас-спектрометрії

Протеоміка — це наука, присвячена вивченню білків у біологічній системі (наприклад, у клітинах, тканинах або організмі) під час певних біологічних процесів. Складність протеоміки полягає в динамічній природі експресії білків, а також у тому, що більшість білків піддається тій чи іншій формі посттрансляційної модифікації.

Найширше протеоміка в медицині та біотехнології почала застосовуватися лише в останні 15 років. В основному це сталося завдяки технологічним досягненням у мас-спектрометрії.

Мас-спектрометрія для аналізу білків

Серед усіх наявних сьогодні методів протеоміки одним із ключових залишається мас-спектрометрія.

Розвиток технологій іонізації макромолекул, зокрема іонізації електророзпиленням і хімічної іонізації під атмосферним тиском, сприяв вивченню структури білка за допомогою мас-спектрометрії. Іонізація також дала можливість ученим отримати «відбитки пальців» білкової маси, які тепер можна зіставити з білками та пептидами в базах даних для їхньої ідентифікації. А нові методи ізотопного мічення посприяли кількісному визначенню цільових білків.

Мас-спектрометри

Протягом останніх двох десятиліть мас-спектрометрія істотно розширила обсяг людських знань про структуру, функції, модифікації та глобальну динаміку білків. Завдяки мас-спектрометру сьогодні можна успішно аналізувати зразки у твердому, рідкому або газоподібному стані. Чутливість сучасних мас-аналізаторів дозволяє виявляти аналіти в концентраціях в аттомолярному діапазоні.

Відносне кількісне визначення

Попри те, що мас-спектрометрія здатна виявляти дуже низькі концентрації аналітів у складних сумішах, вона не є кількісною за своєю природою через значну втрату пептидів та іонів під час аналізу. Отже, пептидні мітки або стандарти одночасно досліджуються зі зразком і є точкою відліку як для відносного, так і для абсолютного кількісного визначення аналіту.

Стратегії відносного кількісного визначення включають мітку стабільних ізотопів з використанням амінокислот у культурі клітин і тандемну мас-мітку. У цих підходах білки або пептиди позначаються стабільними ізотопами, які надають їм виразні зрушення маси в порівнянні з неміченими аналітами. Ця різниця мас може бути виявлена ​​за допомогою мас-спектрометра та забезпечує співвідношення рівнів неміченого та міченого аналіта.

Найчастіше використовують такий метод протеоміки в біотехнології, де безліч білків ідентифікується в широкому динамічному діапазоні з використанням міток різного розміру.

Абсолютне кількісне визначення

Абсолютне кількісне визначення здійснюється в цільових протеомних експериментах і збільшує чутливість виявлення для обмеженої кількості цільових аналітів.

Даний підхід потребує додавання у зразок відомої кількості синтетичних пептидів, що містять важкі стабільні ізотопи. Ці ізотопи діють як внутрішні стандарти для абсолютного кількісного визначення пептидів у зразку.