Протеомика — это область, посвященная изучению белков в биологической системе (например, в клетках, тканях или организме) во время определенных биологических процессов. Сложность протеомики заключается в динамичной природе экспрессии белков, а также в том, что большинство белков подвергается той или иной форме посттрансляционной модификации.
Наиболее широко протеомика в медицине и биотехнологиях начала применяться лишь в последние 15 лет. Во многом — благодаря технологическим достижениям в масс-спектрометрии.
Масс-спектрометрия для анализа белков
Среди всех существующих ныне методов протеомики одним из ключевых остается масс-спектрометрия.
Развитие технологий ионизации макромолекул, включая ионизацию электрораспылением и химическую ионизацию при атмосферном давлении, позволило изучить структуру белка с помощью масс-спектрометрии. Ионизация также дала возможность ученым получить «отпечатки пальцев» белковой массы, которые теперь можно сопоставить с белками и пептидами в базах данных для их идентификации. А новые методы изотопного мечения поспособствовали количественному определению целевых белков.
Масс-спектрометры
В течение последних двух десятилетий масс-спектрометрия существенно расширила объем человеческих знаний о структуре, функции, модификации и глобальной динамике белков. Благодаря масс-спектрометру сегодня можно успешно анализировать образцы в твердом, жидком или газообразном состоянии. Чувствительность современных масс-анализаторов позволяет обнаруживать аналиты в концентрациях в аттомолярном диапазоне.
Относительное количественное определение
Несмотря на то, что масс-спектрометрия может обнаруживать очень низкие концентрации аналитов в сложных смесях, она не является количественной по своей природе из-за значительной потери пептидов и ионов во время анализа. Следовательно, пептидные метки или стандарты одновременно исследуются с образцом и служат точкой отсчета как для относительного, так и для абсолютного количественного определения аналита.
Стратегии относительного количественного определения включают метку стабильных изотопов с использованием аминокислот в культуре клеток и тандемную масс-метку. В этих подходах белки или пептиды помечаются стабильными изотопами, которые придают им отчетливые сдвиги массы по сравнению с немечеными аналитами. Эта разница масс может быть обнаружена с помощью масс-спектрометра и обеспечивает соотношение уровней немеченого и меченого аналита.
Наиболее часто используют такой метод протеомики в биотехнологии, где многие белки идентифицируются в широком динамическом диапазоне с использованием меток разного размера.
Абсолютное количественное определение
Абсолютное количественное определение проводится в целевых протеомных экспериментах и увеличивает чувствительность обнаружения для ограниченного числа целевых аналитов.
Данный подход требует добавления в образец известного количества синтетических пептидов, содержащих тяжелые стабильные изотопы. Эти изотопы действуют как внутренние стандарты для абсолютного количественного определения пептидов в образце.