Що таке імуноферментний аналіз?

Існує кілька форматів, що використовуються для ІФА. Вони поділяються на прямі, непрямі та багатошарові методи захоплення і детекції. Ключовим етапом є іммобілізація антигена, яка здійснюється або шляхом прямої адсорбції на планшеті, або опосередковано, через антитіло захоплення, прикріплене до планшета. Потім антиген виявляється або безпосередньо (мічене первинне антитіло), або побічно (наприклад, мічене вторинне антитіло). Найбільш широко використовуваний ІФА метод – багатошаровий ІФА аналіз, який непрямо іммобілізує і непрямо визначає присутність цільового антигену. Цей тип аналізу називається ще «сендвіч»-аналізом, оскільки вимірюваний аналіт зв’язується між двома первинними антитілами, кожне з яких визначає свій епітоп антигену – антитілом захоплення і антитілом детекції. Сендвіч-метод ІФА широко використовується завдяки своїй чутливості та специфічності.

Діаграма поширених методів ІФА. У цьому аналізі антиген, іммобілізується шляхом прямої адсорбції на пластині або шляхом попереднього прикріплення антитіла захоплення до поверхні пластини. Потім антиген може бути виявлений за допомогою кон’югованого з ферментом первинного антитіла (пряме визначення) або набору немічених первинних і кон’югованих вторинних антитіл (непряме визначення).

У методі прямого виявлення використовується первинне антитіло, мічене ферментом-репортером або міткою, яке реагує безпосередньо з антигеном. Пряме виявлення може здійснюватися з антигеном, безпосередньо іммобілізованим на аналітичній пластині, або у форматі аналізу захоплення. Пряме виявлення, хоча й не використовується широко в ІФА, доволі часто застосовується для імуногістохімічного фарбування тканин і клітин.

Метод непрямого виявлення використовує мічене вторинне антитіло або комплекс біотин-стрептавідин для підсилення і є найбільш популярним форматом ІФА. Вторинне антитіло має специфічність щодо первинного антитіла. У сендвіч-ІФА дуже важливо, щоб вторинне антитіло було специфічним для виявлення тільки первинного антитіла (а не антитіла захоплення), інакше аналіз не буде специфічним для антигену. Як правило, це досягається шляхом використання антитіл захоплення і первинних антитіл із різних видів (наприклад, IgG миші та IgG кролика, відповідно). Для сендвіч-аналізу корисно використовувати вторинні антитіла, які були піддані перехресному адсорбуванню, щоб видалити будь-які вторинні антитіла, які можуть мати спорідненість до антитіла захоплення.

При розробці нового ІФА для конкретного антигену першим кроком є оптимізація умов покриття планшета антигеном або антитілом захоплення. Почніть з вибору мікропланшета для аналізу з мінімальною зв’язуючою здатністю білка 400 нг/см2. Також важливо, щоб значення CV (коефіцієнт варіації) зв’язування білка було низьким (переважно <5%), щоб відхилення в значеннях, які повинні бути ідентичними в результатах аналізу, між лунками і планшетами були обмежені. 

Вибір кольору планшета залежить від сигналу, що визначається. Прозорі полістиролові планшети з плоским дном використовуються для колориметричних сигналів, а чорні або білі непрозорі планшети – для флуоресцентних і хемілюмінесцентних сигналів. Візуально перевіряйте планшети перед використанням, оскільки дефекти або подряпини на пластику можуть спричинити аберації під час отримання даних із розробленого аналізу. 

Планшети для ІФА Thermo Scientific випускаються з різними поверхнями для оптимального нанесення макромолекул за вашим вибором. Ці планшети розроблені для отримання оптимальних результатів і надійної відтворюваності.

Покриття пластин відбувається за рахунок пасивної адсорбції білка на пластику мікропланшета. Цей процес відбувається за рахунок гідрофобних взаємодій між пластиком і неполярними залишками білка. Хоча для оптимального зв’язування окремих білків можуть знадобитися особливі умови або попередня обробка, найпоширеніший метод покриття пластин включає додавання 2-10 мкг/мл розчину білка, розчиненого в лужному буфері, такому як фосфатно-буферний сольовий розчин (pH 7,4) або карбонатно-бікарбонатний буфер (pH 9,4). Планшет залишають для інкубації на кілька годин або на ніч за температури 4-37°С. Зазвичай після видалення розчину покриття додають блокувальний буфер, щоб забезпечити покриття всіх доступних зв’язувальних поверхонь пластикової лунки, що залишилися (див. подальше обговорення). Планшети з покриттям можна використовувати одразу або висушити і зберігати при 4° C для подальшого використання, залежно від стабільності покритого білка.

Повну версію статті шукайте на сайті виробника. 

Читайте також: Огляд мікропланшетного обладнання від Thermo Fisher Scientific для проведення досліджень у мікропланшетах.

Імуноферментний аналіз крові – це дуже специфічний метод діагностики, який завдяки чутливості реакцій допомагає визначити такі хвороби як вірусні гепатити, онкологію, бактеріальні та паразитарні інфекції, аутоімунні захворювання.

У нас ви знайдете необхідне обладнання, яке допоможе якісно та швидко проводити дослідження.