Иммуноферментный анализ крови: прямой, непрямой и многослойный методы

Существует несколько форматов, используемых для ИФА. Они делятся на прямые, непрямые и многослойные методы захвата и детекции. Ключевым этапом является иммобилизация интересующего антигена, которая осуществляется либо путем прямой адсорбции на планшете, либо косвенно, через антитело захвата, прикрепленное к планшету. Затем антиген обнаруживается либо напрямую (меченое первичное антитело), либо косвенно (например, меченое вторичное антитело). Наиболее широко используемый ИФА метод  – многослойный ИФА анализ, который непрямо иммобилизует и непрямо определяет присутствие целевого антигена. Этот тип анализа называется еще «сэндвич»-анализом, поскольку измеряемый аналит связывается между двумя первичными антителами, каждое из которых определяет свой эпитоп антигена – антителом захвата и антителом детекции. Сэндвич-метод ИФА широко используется благодаря своей чувствительности и специфичности.

Диаграмма распространенных методов ИФА. В этом анализе интересующий антиген иммобилизуется путем прямой адсорбции на пластине или путем предварительного прикрепления антитела захвата к поверхности пластины. Затем антиген может быть обнаружен с помощью конъюгированного с ферментом первичного антитела (прямое определение) или набора немеченых первичных и конъюгированных вторичных антител (непрямое определение).

В методе прямого обнаружения используется первичное антитело, меченное ферментом-репортером или меткой, которое реагирует непосредственно с антигеном. Прямое обнаружение может осуществляться с антигеном, непосредственно иммобилизованным на аналитической пластине, или в формате анализа захвата. Прямое обнаружение, хотя и не используется широко в ИФА, довольно часто применяется для иммуногистохимического окрашивания тканей и клеток.

Метод непрямого обнаружения использует меченое вторичное антитело или комплекс биотин-стрептавидин для усиления и является наиболее популярным форматом ИФА. Вторичное антитело обладает специфичностью по отношению к первичному антителу. В сэндвич-ИФА очень важно, чтобы вторичное антитело было специфичным для обнаружения только первичного антитела (а не антитела захвата), иначе анализ не будет специфичным для антигена. Как правило, это достигается путем использования антител захвата и первичных антител из разных видов (например, IgG мыши и IgG кролика, соответственно). Для сэндвич-анализа полезно использовать вторичные антитела, которые были подвергнуты перекрестному адсорбированию, чтобы удалить любые вторичные антитела, которые могут иметь сродство к антителу захвата.

При разработке нового ИФА для конкретного антигена первым шагом является оптимизация условий покрытия планшета антигеном или антителом захвата. Начните с выбора микропланшета для анализа с минимальной связывающей способностью белка 400 нг/см2. Также важно, чтобы значение CV (коэффициент вариации) связывания белка было низким (предпочтительно <5%), чтобы отклонения в значениях, которые должны быть идентичными в результатах анализа, между лунками и планшетами были ограничены. 

Выбор цвета планшета зависит от определяемого сигнала. Прозрачные полистироловые планшеты с плоским дном используются для колориметрических сигналов, а черные или белые непрозрачные планшеты – для флуоресцентных и хемилюминесцентных сигналов. Визуально проверяйте планшеты перед использованием, так как дефекты или царапины на пластике могут вызвать аберрации при получении данных из разработанного анализа. 

Планшеты для ИФА Thermo Scientific выпускаются с различными поверхностями для оптимального нанесения макромолекул по вашему выбору. Эти планшеты разработаны для получения оптимальных результатов и надежной воспроизводимости.

Покрытие пластин происходит за счет пассивной адсорбции белка на пластике микропланшета. Этот процесс происходит за счет гидрофобных взаимодействий между пластиком и неполярными остатками белка. Хотя для оптимального связывания отдельных белков могут потребоваться особые условия или предварительная обработка, наиболее распространенный метод покрытия пластин включает добавление 2-10 мкг/мл раствора белка, растворенного в щелочном буфере, таком как фосфатно-буферный солевой раствор (pH 7,4) или карбонатно-бикарбонатный буфер (pH 9,4). Планшет оставляют для инкубации на несколько часов или на ночь при температуре 4-37°С. Обычно после удаления раствора покрытия добавляют блокирующий буфер, чтобы обеспечить покрытие всех оставшихся доступных связывающих поверхностей пластиковой лунки (см. последующее обсуждение). Планшеты с покрытием можно использовать сразу или высушить и хранить при 4° C для последующего использования, в зависимости от стабильности покрытого белка.

Полную версию статьи ищите на сайте производителя. 

Читайте также: Обзор микропланшетного оборудования от Thermo Fisher Scientific для проведения исследований в микропланшетах.

Иммуноферментный анализ крови – это очень специфический метод диагностики, который благодаря чувствительности реакций помогает определить такие болезни как вирусные гепатиты, онкологию, бактериальные и паразитарные инфекции, аутоиммунные заболевания.

У нас вы найдете необходимое оборудование, которое поможет качественно и быстро проводить исследования.