Укр
Рус Укр Eng

Оцінка ефективності інактивації патогенних мікроорганізмів в тромбоцитарному компоненті двох комерційно доступних систем: ефективність наприкінці завершення терміну зберігання

В даній статті приведені результати дослідження ефективності двох комерційно доступних систем для інактивації патогенів: Мірасол та Інтерсепт.

* Джерело: оригінальна стаття Vox Sanguinis. Міжнародне товариство трансфузії крові

* Автор-кореспондент: Carl McDonald, Microbiology Services Laboratory –Bacteriology, NHS Blood and Transplant, Charcot Road, London, NW9 5BG, U.K.

Історія питання та завдання

Ефективність двох комерційно доступних систем для інактивації патогенів (ІП) в тромбоцитарних компонентах крові (ТК) – Мірасол та Інтерсепт – оцінювалась через аналіз відсутності життєздатних бактерій у всьому вмісті ТК наприкінці терміну його придатності. 

Методи. Був застосований метод пул-енд-спліт (об’єднані зразки донорської крові, надалі розділені) з двома обробленими зразками та одним необробленим контрольним зразком  на засів кожної з концентрацій. В пари пакетів з ТК засівали по одному виду бактерій. Три концентрації (n = 2 для кожної з концентрацій), з десятикратним збільшенням, спочатку були перевірені на основі даних, опублікованих виробником. В залежності від отриманих результатів, концентрацію, що перевіряли надалі, збільшували чи зменшували, аж до визначення здатності системи забезпечувати інактивацію. Кількість бактерій оцінювали після додавання, одразу перед обробкою (через дві години після додавання), одразу після обробки та на етапі завершення терміну зберігання (день сьомий). Збагачення культури здійснювали безпосередньо перед обробкою, після обробки та на етапі завершення терміну зберігання.

Результати. Ефективність інактивації, в КУО/мл, систем Інтерсепт та Мірасол, відповідно, на етапі завершення терміну зберігання ТК була наступною: Staphylococcus aureus ≥ 107, < 101; Staphylococcus epidermidis ≥ 106, < 102; Klebsiella pneumoniae 105, < 101; Streptococcus bovis ≥ 107, 101, Escherichia coli ≥ 106, <101; Streptococcus pneumoniae ≥ 106, 103; Streptococcus mitis ≥ 107, 101; Listeria monocytogenes ≥ 107, < 101; Streptococcus dysgalactiae ≥ 107, < 101; Serratia marcescens 103, < 101; Pseudomonas aeruginosa 103, систему Мірасол не перевіряли; та Bacillus cereus < 102, систему Мірасол не перевіряли.

Висновок. Ефективність інактивації системою Інтерсепт була вищою ніж Мірасол. Ефективність інактивації  (забезпечення термінальної стерильності) є найважливішою оцінкою  системи ІП за показниками знищення бактерій, ніж оцінка логарифмічного зниження вмісту бактерій в чашках одразу  після обробки. ІП надає альтернативу перевірці на вміст бактерій, якщо обробка проведена в належний час з урахуванням здатності системи забезпечувати інактивацію. 

Ключові слова: бактерії, безпека крові, інактивація патогенних мікроорганізмів, тромбоцитарний компонент.

Вступ

Передавання бактерій під час трансфузій крові залишається істотною проблемою трансфузійної медицини. У Великобританії за схемою «Серйозні небезпеки, асоційовані з трансфузією» (SHOT), в межах нагляду за безпекою переливання крові, було зафіксовано 44 випадки зараження бактеріями під час трансфузії за період з 1996 по 2018 рік, переливання тромбоцитарного компонента (ТК) становило 84% від усіх випадків (1). Повідомлено про 11 смертей: два випадки – після переливання еритроцитарної маси та дев’ять – ТК. В Німеччині 124 випадки зараження бактеріями були підтверджені за період з 1997 про 2017 рік, з них 72 – при трансфузії ТК, 47 –  еритроцитарної маси та п’ять – при переливанні свіжозамороженої плазми. Зареєстровано 17 випадків смерті: 13 – після переливання ТК та чотири – еритроцитарної маси (2 –  5).

Відділом переливання крові та трансплантації NHS (NHSBT) було ініційовано проведення дослідження в 1999 році для оцінки рівня забруднення бактеріями та ідентифікації виявлених мікроорганізмів в ТК та еритроцитарній масі. Були перевірені зразки ТК та еритроцитарної маси після завершення терміну зберігання. Отримані результати свідчать про те, що в більшості випадків були виявлені представники мікрофлори шкіри (6). З урахуванням отриманих результатів NHSBT були проведені подальші дослідження для оцінки ефективності низки заходів для зменшення ризику контамінації компонентів крові. Зокрема, було вдосконалено дезінфекцію шкіри руки донора (7), а перші 30 мл крові зливались і не потрапляли до пакету для збирання крові (8). Перелічені заходи є надзвичайно ефективними для зменшення контамінації. Додаткова обробка шкіри руки донора та злиття забезпечили зниження забруднення на 57% та 47% відповідно (8). В комбінації ці два заходи забезпечили зниження на 77%. NHSBT запровадив практику злиття в 2002 році, а вдосконалену дезінфекційну обробку шкіри руки донора – в 2005 році. До впровадження цих заходів, в період 1995 – 2001 років, NHSBT було зареєстровано, в цілому, 23 інциденти передачі (включно з п’ятьма випадками з летальним наслідком). З них 20 випадків при переливанні ТК (чотири летальні випадки) та 3 при переливанні еритроцитарної маси (один летальний випадок)т(9). Після впровадження цих заходів, в період з 2006 по 2010 рік, було зареєстровано 10 випадків бактеріальної передачі,  включно з 4 випадками з летальним наслідком. Сім з цих випадків сталися при переливанні ТК, з них 3 з летальним наслідком (10). Також було зареєстровано 5 випадків, коли забруднення ТК було виявлене за результатом візуальної перевірки перед трансфузією. Цей період збігався зі збільшенням повідомлень про небажані явища, зумовленим впровадженням директиви ЄС в 2005 році, якою вимагається обов’язкове, а не добровільне повідомлення про явища (11).

Бактеріальний скринінг усіх зразків ТК був впроваджений NHSBT в 2011 році, як захід для подальшого зниження ризику. Для перевірки застосовували автоматичну систему виявлення мікроорганізмів ВасТ/ALERT 3D (bioMerieux Ltd, Дарем, Північна Кароліна, США) (12). Це втручання виявилось успішним, оскільки після його впровадження й дотепер було зареєстровано один підтверджений та один підозрюваний випадок передачі та чотири випадки, що не відбулись, на понад 2,4 млн перевірених зразків ТК без випадків з летальним наслідком (1).

Мірасол (Terumo BCT, Лейквуд, Колорадо, США) та Інтерсепт (Cereus Corporation, Конкород, Каліфорнія, США) є єдиними системами для інактивації патогенних мікроорганізмів (ІП), що комерційно доступні у Великобританії та являються потенційною альтернативою бактеріальному скринінгу. Обидві системи запобігають реплікації ДНК / РНК, хоча механізми їхньої дії є різними. Система Інтерсепт ґрунтується на фотохімічному методі, в ній використовується амотосален.  Цей синтезований псорален проникає через клітинні та ядерні мембрани та зв’язує двоспіральні ділянки ДНК та РНК. УФ світло низької енергії (320 – 400 нм) активує амотосален, який зв’язує нуклеїнові кислоти, а отже блокує реплікацію ДНК/РНК. В цій системі використовується композитний абсорбційний прилад (КАП) для видалення залишків амотосалену та продуктів фотосинтезу (13). Система Мірасол ґрунтується на використанні рибофлавіну (вітамін В2), який діє в якості фотосенсибілізатора. Під впливом УФА та УФВ світла (280 – 400 нм) він опосередковує селективне ушкодження нуклеїнових кислот без зв’язування з клітинами чи білками. Рибофлавін зв’язується з нуклеїновими кислотами та опосередковує незалежний від кисню перехід електронів, наслідком чого є незворотне ушкодження нуклеїнових кислот. Оскільки рибофлавін є природним вітаміном і продукти його розпаду під впливом світла вважаються нетоксичними, етап видалення залишків цього процесу є непотрібним (14).

Задачею нашого дослідження була оцінка ефективності систем  Мірасол та Інтерспет забезпечувати інактивацію певних бактерій. Інактивація була визначена як відсутність життєздатних бактерій на етапі завершення терміну зберігання зі збагаченням культури (термінальна стерильність). В багатьох дослідження ІП, проведених дотепер (наприклад в дослідженні Lin та співавторів, 2004 року), ефективність інактивації бактерій оцінювали за показником логарифмічного зменшення, тобто за оцінкою зниження концентрації бактерій безпосередньо після обробки в порівнянні із концентрацією до обробки, що, на нашу думку, є невідповідною методикою (15). 

Дивіться вебінар: Інактивація патогенів у крові та плазмі для покращення здоров’я та самопочуття пацієнтів

Метод

Дизайн дослідження

В дослідженні був використаний метод пул-енд-спліт для створення гомогенних зразків ТК для перевірки кожного з досліджених видів бактерій. Для перевірки вмісту бактерій одного виду використовували по два мішка, що піддавали  обробці, та один контрольний мішок, до яких додавали бактерії цього виду в кожній з досліджених концентрацій (Мал. 1). На початку були перевірені три концентрації (n = 2 для кожної з концентрацій), з десятикратним збільшенням та з урахуванням даних, опублікованих виробником (16, 17). Діапазон концентрацій залежав від виду бактерій, що перевірялися. В залежності від отриманих результатів концентрацію, що перевіряли надалі, збільшували чи зменшували, аж до визначення здатності системи забезпечувати інактивацію. Усі зразки залишали на дві години після додавання, для врівноваження бактерій в середовищі мішка перед ІП обробкою. Усі мішки зі зразками, використані для аналізу, зберігали при постійному струшуванні при температурі 22 ± 2°С, за винятком періодів взяття з них зразків та обробки. Кількість бактерій в кожному зі зразків визначали методом посіву в агар після  додавання, одразу перед обробкою, одразу після обробки та на етапі завершення семиденного терміну зберігання тромбоцитів. Збагачення культури, з використанням системи ВасТ/ALERT,  здійснювали в усі часові точки, за винятком точки після додавання.

Ефективність інактивації системи для  кожного з перевірених мікроорганізмів була визначена, як найвища концентрація (КУО/мл) бактерій, для якої була виявлена відсутність розмноження життєздатних бактерій при збагаченні середовища в обох аналогічних зразках ТК на етапі завершення терміну зберігання (термінальна стерильність). Для порівняння, для оцінки стерильності застосовували також і метод підрахунку в чашках на етапі завершення терміну зберігання. Найвищу концентрацію (КУО/мл) для кожного з видів бактерій, що могла бути інактивована до стерильності, визначали також і одразу після обробки (з порівняльною метою), методом підрахунку в чашці та зі збагаченням культури, в двох флаконах (аеробні та анаеробні умови).

Мал. 1 Схематичне зображення методики оцінки ефективності систем для інактивації патогенних мікроорганізмів.

Рис. 1 Схематичне зображення методики оцінки ефективності систем для інактивації патогенних мікроорганізмів.

Бактеріальні штами

Використані клінічно значущі штами були отримані шляхом бактеріальної  трансмісії (БТ), бактеріального скринінгу (БС), з одного зараженого зразка та виявлені при візуальній інспекції (ВІ). Один ізолят був отриманий з Американської колекції типових культур (ATCC) (LGC Standards, Теддінгтон, Великобританія).

Для перевірки систем Мірасол та Інтерсепт були використані наступні десять видів мікроорганізмів: Staphylococcus aureus (ВІ), Staphylococcus epidermidis (БТ), Klebsiella pneumonia (BT), Streptococcus bovis (БТ), Escherichia coli (БТ), Streptococcus pneumonia (БТ), Streptococcus mitis (ATCC 6249), Listeria monocytogenes (БС), Streptococcus dysgalactiae (БС) та Serratia marcescens (БС). Два додаткові мікроорганізми були оброблені системою Інтерсепт, оскільки були наявні додаткові мішки для обробки: Pseudomonas aeruginosa (БС) та Bacillus cereus (БТ, вегетативна форма). Жоден з виробників ІП систем не надавав гарантій щодо інактивації бактеріальних  спор, які можуть утворювати такі види, як Bacillus та Clostridium.

Отримання та підготовка тромбоцитів

Для дослідження використали цільну  кров з лейкотромбоцитарного шару, ТК з комбінованого зразка (ТКК) та зі зразків, отриманих від донорів, що дали згоду, з додаванням в перший день періоду зберігання  (наступного дня після отримання донації). Проведення дослідження було схвалене комітетом з етики. Тромбоцити були суспендовані в середовищі з приблизно 65% SSP + додатковий розчин тромбоцитів ((PAS) (Macopharma, Муво, Франція) та 35% плазми, виробленого згідно зі специфікацією, яку рекомендував  виробник ІП систем (18, 19).

Для отримання гомогенних зразків до початку аналізу ТК (n = 9) з усіх донацій були об’єднані і надалі розподілені по три аналогічних зразки на серію: по одній серії на кожну концентрацію для кожного з досліджених видів мікроорганізмів (діапазон: 255 – 325 мл для системи Інтерсепт, 250 – 450 мл для системи Мірасол). Два зразки з трьох були призначені для обробки, а третій використовували в якості контрольного зразка, який не надавався обробці. 

Стерильний сполучний елемент (B Braun Ltd, Шеффілд, Великобританія) було встановлено з дотриманням асептичних умов: в порт кожного мішка з ТК, для посіву бактерій та подальшого отримання зразків.

Підготовка бактерій для посіву

Культури мікроорганізмів були підготовлені з кріоконсервованих зразків в чашках з колумбійським кров’яним агаром з додаванням 5% конячої крові (Oxoid Ltd, Бейсингсток, Великобританія), для оцінки життєздатності та підтвердження наявності представників обраного виду. Суспензію (0,5 – 1,0 МакФарланд), приблизно 108 КУО/мл, готували в стерильному 0,85% сольовому розчині, з подальшим приготуванням серійних десятикратних розведень для отримання належної концентрації бактерій. Були приготовлені по два зразки суспензій трьох фінальних концентрацій і потім висіяні в чашки з агаром для оцінки кількості засіяних бактерій. Чашки інкубували в аеробних умовах протягом 24 годин при температурі 35 ± 2°С.

Посів в мішки з тромбоцитами

Бактерії у відповідній концентрації засівали в мішки з ТК через встановлений сполучний елемент. При цьому використовували стерильний гіпотермічний шприц, тричі промитий в ТК.

ІП обробка

Усі зразки ТК, за винятком контрольних, обробляли через дві години після посіву. Весь персонал отримав належне навчання та був атестований виробником для використання відповідної ІП системи. Для обробки були обрані система Набір Інтерсепт для обробки малих об’ємів тромбоцитів (INT 21). Тривалість КАП етапу становила 13,7 – 15,5 год. Для обробки системою Мірасол були використані одноразові набори Mirasol® Platelet Disposable Kit в PAS (10790). 

Середовище для збагачення та підрахунок безпосередньо в чашках

Збагачені культури були підготовлені з маточного зразка, отриманого методом пул-енд-спліт, та перевірені системою BacT/ALERT 3D (bioMerieux) для підтвердження відсутності бактерій перед додаванням. Здійснювали додавання двох типів мікроорганізмів (розподіл за потребою в атмосферному кисні, тобто аеробні та анаеробні). 

Мішки з ТК також були перевірені додаванням збагаченої культури безпосередньо перед початком освітлення (по одному флакону з мікроорганізмами кожного з типів за потребою в атмосферному кисню) та одразу після обробки (також по одному флакону для кожного з типів мікроорганізмів). В день сьомий були підготовлені пари флаконів з усього залишкового вмісту мішків з ТК. До всіх флаконів BacT/ALERТ, використаних в дослідженні, з аеробними та анаеробними мікроорганізмами, було засіяно по 8 мл, з подальшою інкубацією в системі BacT/ALERТ протягом сімох днів при температурі 36 ± 1°С.

Вміст усіх флаконів BacT/ALERТ, помічених як позитивні в період інкубування, був пересіяний в чашки з колумбійським кров’яним агаром з додаванням 5% конячої крові, для ідентифікації виявлених мікроорганізмів. Для ідентифікацій видів були використані системи Phoenix 100 чи BBL Crystal (обидві BD: Becton, Dickinson UK Ltd, Вокінгхем, Великобританія).

Зразки отримували також і після додавання: в кожній з часових точок, для оцінки вмісту методом безпосереднього підрахунку в чашках. Була застосована методика розрівнювання шпателем «хокейна ключка». Об’єм зразка становив по 100 мкл/чашка, кожний зі зразків був приготований серією з двох. Чашки інкубували протягом мінімум 24 годин, при температурі 35 ± 2°С, після чого здійснювали підрахунок кількості бактерій. 

Результати

На Рис. 2 проілюстрована здатність до інактивації мікроорганізмів, перевірених в нашому дослідженні, забезпечувана системами Інтерсепт та Мірасол. Система Інтерсепт забезпечує більшу ефективність інактивації мікроорганізмів, перевірених в нашому дослідженні, в порівнянні з  системою Мірасол. Усі дані щодо можливостей інактивації та стерильності наведені в десятих степенях.

Мал. 2 Порівняння здатності до інактивації систем Інтерсепт та Мірасол. *Здатність ≥  визначена найбільша концентрація. †Здатність ≤  визначена найнижча концентрація (<102 КУО/мл для В. cereus та S. Epidermidis; < 101 КУО/мл для інших видів).

Рис. 2 Порівняння здатності до інактивації систем Інтерсепт та Мірасол. *Здатність ≥ визначена найбільша концентрація. †Здатність ≤ визначена найнижча концентрація (<102 КУО/мл для В. cereus та S. Epidermidis; < 101 КУО/мл для інших видів).

На рис. 3 проілюстрована найвища концентрація (КУО/мл) для кожного з видів мікроорганізмів, перевірених в нашому дослідженні. Їхня інактивація до стану стерильності може бути забезпечена системою Інтерсепт одразу після обробки та на етапі завершення терміну придатності. За винятком P. aeruginosa та S. marcescens, рівень інактивації до стерильності був ідентичним як при визначенні одразу після обробки так і в день сьомий. Для P. aeruginosa та S. marcescens, рівень інактивації знижувався з 102 до 101 КУО/мл в день сьомий: оцінка відбувалася методом підрахунку в чашці. Для збагаченої культури S. marcescens зниження здатності до інактивації на етапі завершення терміну зберігання становило 101 КУО/мл.

Рис. 3 Порівняння показників рівня інактивації до стерильності, одразу після обробки та після завершення терміну зберігання. Система Інтерсепт. *Рівень інактивації ≥  визначена найбільша концентрація. †Рівень інактивації ≤  визначена найнижча концентрація (102 КУО/мл).

Рис. 3 Порівняння показників рівня інактивації до стерильності, одразу після обробки та після завершення терміну зберігання. Система Інтерсепт. *Рівень інактивації ≥ визначена найбільша концентрація. †Рівень інактивації ≤ визначена найнижча концентрація (102 КУО/мл).

На рис. 4 наведене порівняння найбільших концентрацій (КУО/мл) для кожного з видів перевірених бактерій, що можуть бути інактивовані до стерильності при використанні системи Мірасол (одразу після обробки та в день сьомий). Для усіх мікроорганізмів відмічене зниження рівня стерильності в день сьомий в порівнянні із показником, визначеним одразу після обробки (101 до 105 КУО/мл). Оцінка відбувалася методом підрахунку в чашці. Щодо збагаченої культури, зниження здатності до інактивації становило, принаймні, 101 КУО/мл для усіх видів (за винятком S. mitis та S. marcescens).

На рис. 4 наведене порівняння найбільших концентрацій (КУО/мл) для кожного з видів перевірених бактерій, що можуть бути інактивовані до стерильності при використанні системи Мірасол (одразу після обробки та в день сьомий). Для усіх мікроорганізмів відмічене зниження рівня стерильності в день сьомий в порівнянні із показником, визначеним одразу після обробки (101 до 105 КУО/мл). Оцінка відбувалася методом підрахунку в чашці. Щодо збагаченої культури, зниження здатності до інактивації становило, принаймні, 101 КУО/мл для усіх видів (за винятком S. mitis та S. marcescens).

На рис. 4 наведене порівняння найбільших концентрацій (КУО/мл) для кожного з видів перевірених бактерій, що можуть бути інактивовані до стерильності при використанні системи Мірасол (одразу після обробки та в день сьомий). Для усіх мікроорганізмів відмічене зниження рівня стерильності в день сьомий в порівнянні із показником, визначеним одразу після обробки (101 до 105 КУО/мл). Оцінка відбувалася методом підрахунку в чашці. Щодо збагаченої культури, зниження здатності до інактивації становило, принаймні, 101 КУО/мл для усіх видів (за винятком S. mitis та S. marcescens).

На рис. 5 показана кількість бактерій, визначена методом підрахунку в чашках: до обробки, безпосередньо після обробки та після завершення терміну зберігання (при використанні системи Мірасол). Концентрація первинного додавання становила 103 КУО/мл. Перед обробкою цільова концентрація становила порядку 103 КУО/мл. Одразу після обробки бактерії виявлені не були, а в день сьомий не було виявлене розмноження всіх перевірених мікроорганізмів (за винятком одного зразка з серії S. Epidermidis та в обох зразках серії S. pneumoniae). В збагаченій культурі були виявлені усі організми після обробки в принаймні одному зі зразків серії (за винятком S. aureus, S. pneumoniae та S. epidermidis).

Рис. 5 Кількість бактерій до обробки в системі Мірасол, концентрація бактерій  103 КУО/мл, негайно після обробки та після завершення терміну зберігання (день 7), оцінка методом підрахунку в чашках. Після обробки розмноження є нижчим за межу виявлення для усіх видів.

Рис. 5 Кількість бактерій до обробки в системі Мірасол, концентрація бактерій 103 КУО/мл, негайно після обробки та після завершення терміну зберігання (день 7), оцінка методом підрахунку в чашках. Після обробки розмноження є нижчим за межу виявлення для усіх видів.

Обговорення

Системою Інтерсепт продемонстрована більша ефективність інактивації усіх мікроорганізмів в порівнянні з  системою Мірасол (ри. 2). В нашому дослідженні концентрація бактерій, інактивацію до стерильності яких забезпечувала система Інтерсепт, була більшою, ніж при використанні системи Мірасол, за результатами перевірки одразу після обробки та після завершення терміну зберігання ТК (термінальна стерильність, рис. 3 та 4). Ці результати збігаються з даними Kwon та співавторів, отриманими в дослідженні з безпосереднім порівнянням, на відміну від дослідження, проведеного нами. Логарифмічне зниження, виявлене Kwon та співавторами, з використанням систем Мірасол та Інтерсепт, становило: E.coli 5,45 в порівнянні із 9,22; S. aureus 4,26 в порівнянні із ≥ 10,11 та B. cereus 5,09 в порівнянні із 7,74, відповідно (20). Причина різниці між ефективністю інактивації систем Мірасол та Інтерсепт є невідомою та потребує проведення подальших досліджень. Можливо, це зумовлено різницею здатності до проникнення активних речовин, що застосовувалися в кожній із систем (рибофлавін та амотосален), через бактеріальну стіну, дозою світла та / або застосуванням світла з різною довжиною хвилі.

Рівень інактивації до стерильності при використанні системи Інтерсепт (негайно після обробки та після завершення терміну зберігання) був однаковим для всіх видів, за винятком P. aeruginosa та S. marcescens. Оцінка проводилася методом підрахунку в чашках (Мал. 3). Здатність до термінальної активації, забезпечувана системою  Інтерсепт, дорівнювала чи перевищувала найбільшу з оцінених концентрацій (106 – 107 КУО/мл), для усіх видів, за винятком K. pneumoniae (105 КУО/мл), P. aeruginosa (103 КУО/мл), S. marcescens (103 КУО/мл) та B. cereus (< 102 КУО/мл).

Рівень інактивації до стерильності при використанні системи Мірасол (негайно після обробки) був істотно нижчим для усіх перевірених видів (діапазон 101 – 105 КУО/мл). Оцінка проводилася методом підрахунку в чашка (Мал. 4). При перевірці здатності до інактивації, визначеної методом збагачення культури, цей ефект був менш виразним. 

Логарифмічне зменшення при оцінці одразу після обробки (оцінка методом підрахунку в чашках) не є належним показником для оцінки здатності ІП системи до інактивації бактерій, внаслідок потенційного розмноження залишкових неінактивованих бактерій, які з часом можуть розмножуватись до потенційно патогенного рівня. Це проілюстровано на Мал. 5 даними, отриманими в дослідженні, коли бактерії в концентрації 103 КУО/мл були додані до КТ (індивідуальне додавання 10 видів мікроорганізмів) і зразки були оброблені в системі Мірасол. Розмноження не було виявлене за результатами перевірки одразу після додавання (метод підрахунку в чашках) при використанні всіх досліджених мікроорганізмів, що відповідає логарифмічному зниженню ≥ 3,0. Також в день сьомий було виявлене істотне збільшення (105 – 109 КУО/мл) вмісту всіх перевірених мікроорганізмів (метод підрахунку в чашках), за винятком S. pneumoniae та одного із зразків з серії S.epidermidis. Jacobs та співавтори, за результатами дослідження, задачею якого була оцінка бактеріальної концентрації здатної викликати тяжку, але не летальну реакцію після трансфузії, стверджують, що відповідна концентрація становить 105 КУО/мл (21). Такий саме феномен був виявлений при використанні системи Інтерсепт, при доданні P. aeruginosa та S. marcescens в концентрації 104 КУО/мл, коли розмноження не було виявлене негайно після обробки, але на етапі завершення терміну придатності було виявлене проривне збільшення. За нашим висновком, термінальна стерильність на етапі завершення терміну зберігання є оптимальним методом оцінки здатності ІП системи знищувати бактерії. Це значення виражали в КУО/мл в нашому дослідженні, тоді як логарифмічне зменшення є безрозмірним параметром, а отже є відкритим для тлумачення. Тип мішка, об’єм та середовище для приготування суспензії також можуть впливати на ефективність інактивації. Слід підкреслити, що кожна система була ретельно перевірена із використанням збагаченої культури, оскільки залишковий вміст в кожному мішку з тромбоцитами перевіряли системою BacT/ALERT, що, наскільки нам відомо, не здійснювали в жодному іншому дослідженні. 

Результати нашого дослідження свідчать про те, що здатність до інактивації бактерій залежить від виду, а також  від перевіреного штаму, що було продемонстровано в інших дослідженнях, і може пояснювати розбіжності рівня інактивації, встановлені нами та вказані виробником (рис. 2) (22, 23). Це підкреслює необхідність валідації ІП системи з використанням великої кількості видів та штамів бактерій. 

Жоден з виробників не заявляв здатності до інактивації спор, утворюваних такими мікроорганізмами, як Bacillus cereus та Clostridium perfringens. Спори є «Ахіллесовою п’ятою» усіх наявних наразі ІП систем. Для порівняння, недоліком систем для скринінгу бактеріальних культур є нездатність виявляти бактерії, що повільно розмножуються, або бактерії з тривалою лаг-фазою, оскільки кількість бактерій може бути замалою для виявлення у взятому зразку. Передачі, включно з випадками з летальними наслідками, викликаними бактеріями, що утворюють спори (один з таких випадків стався  при використанні ІП NHSBT до впровадження бактеріального скринінгу), описані в літературних джерелах (24 – 26). Вони сталися  при використанні КТ, не обробленого  ІП. Малоймовірно, що такі мікроорганізми можуть бути присутні в КТ лише у вегетативній формі. Лише три спороутворюючі бактерії були підтверджені  NHSBT за період з лютого 2011 по грудень 2019 року, за результатами скринінгу 2,4 млн. КТ. Тобто частота становить 1 на 800 000 КТ (персональне спілкування з Su Brailsford). В Сполучених Штатах представниками Bacillus було представлено близько 1,4% усіх бактерій, виявлених при проведенні стандартного бактеріального скринінгу, вони стали причиною однієї з 68 повідомлених септичних реакцій після впровадження обов’язкового скринінгу в 2004 році (25, 27). Нещодавно в Сполучених Штатах вмерли два пацієнти після переливання ТК: були виявлені Clostridium perfringens (28). Бактеріальний посів був проведений через 24 години після отримання донорської крові, але анаеробний флакон, що є оптимальним методом виявлення анаеробних мікроорганізмів, не використовували. Управлінням контролю харчових продуктів та лікарських засобів (FDA) опублікована офіційна настанова в зв’язку з цією проблемою: впроваджений пізніший час для взяття зразка та обов’язкове використання анаеробного флакону (29). Бактеріальний скринінг є методом-замінником перевірки еритроцитарної маси, асоційованої з об’єднаними зразками ТК, отриманими NHSBT, що не забезпечується ІП (30).

Час обробки є надзвичайно важливим для успішного застосування ІП системи. Wagner та співавтори, а також Schmidt та співавтори в незалежно проведених дослідженнях продемонстрували, що при доданні низької концентрації в системі Інтерсепт можливий проривний ріст K. pneumoniae, якщо обробка не проведена вчасно (23, 31). Wagner та співавтори продемонстрували проривний ріст в одному зразку з серії з трьох, з доданням малої кількості бактерій (7 – 9 КУО/мішок), через 30 год., але не через 24 год., хоча інший штам K. pneumoniae був повністю інактивованим в обидві часові точки, що свідчить про варіацію штаму. Був виявлений проривний ріст в день п’ятий терміну зберігання, концентрація становила 1 х 109 КУО/мл, що є потенційно загрозливою для життя концентрацією цього грамнегативного мікроорганізму. 

Зв’язок між ефективністю інактивації та часом обробки полягає в тому, що чим більшою є здатність системи до інактивації, тим більшим може бути час до обробки. Час до обробки повинен ґрунтуватись на кінетиці розмноження мікроорганізмів, здатність інактивації (забезпечення термінальної стерильності) яких є найнижчою, а також на кінетиці розмноження мікроорганізмів, здатних до швидкого розмноження. У випадку системи Інтерсепт, за даними нашого дослідження, такими мікроорганізмами є P. aeruginosa та S. marcescens. Належний час для ІП є критичним фактором для максимального підвищення безпеки. Чим меншою є тривалість періоду між отриманням донорської крові та обробкою, тим вищим є рівень безпеки. Дані нашого дослідження свідчать про те, що обробку із застосуванням системи Мірасол слід проводити відразу для забезпечення максимальної користі, тоді як обробку із застосуванням системи Інтерсепт можна проводити набагато пізніше після донації, що забезпечує більшу операційну гнучкість. Максимальний час до обробки, заявлений компанією Церус (Cerus) при використанні системи Інтерсепт в Європі, становить: до кінця дня при використанні методів аферезу та РРС для підготовки ТК та при семиденному терміні зберігання ТК (18). В Сполучених Штатах система Інтерсепт є єдиною ліцензованою FDA для обробки ТК, отриманого методом аферезу. Обробка повинна бути проведена протягом періоду ≤ 24 год. після донації, а термін зберігання становить п’ять днів (32). На чому ґрунтується зазначений час до обробки, невідомо, втім в роботі Wagner та співавторів, а також Schmidt та співавторів, поставлене запитання щодо часу до обробки з використанням систем Інтерсепт, відмінного від рекомендованого в Сполучених Штатах (23, 32). Отримані нами дані свідчать про те, що семиденний термін зберігання є безпечним, хоча необхідні подальші дослідження для валідації часу до обробки, та використання клінічних даних, отриманих в Європі, при зберіганні протягом сімох днів. 

Terumo BCT стверджує, що при використанні системи Мірасол, отриманий методом аферезу ТК слід обробляти в період від двох до 22 год. після донації; методом РРС – протягом 8 год після отримання чи ≤ 32 год після донації (19). В дослідженні, проведеному Terumo BCT, в якому обробку проводили через дві години після додавання до ТК, індивідуально, 13 мікроорганізмів (20 штамів), проривний ріст спостерігали в залежності від концентрації початкового додавання (22). Дані цього дослідження свідчать про те, що система Мірасол не є 100% ефективною навіть при мінімальній тривалості періоду до обробки при початковому додаванні мікроорганізмів в низькій концентрації (< 20 КУО/зразок).

В системі Макофарма Терафлекс УФ використовують світло УФ спектру С, без додавання хімічних речовин, на відміну від систем Мірасол та Інтерсепт (33). Наразі проводяться клінічні дослідження системи Терафлекс, вона не є комерційно доступною. Ця система є єдиною, для якої були опубліковані дані, отримані для величезної кількості мікроорганізмів, на яких ґрунтується тривалість періоду до обробки. Експерименти з додаванням були проведені з використанням 14 референсних штамів ВООЗ, які додавали в ТК індивідуально, в концентрації 45 – 285 КУО/зразок. Для кожного з перевірених мікроорганізмів була використана серія з 12 ідентичних зразків (34). ІП обробка була проведена через 6 та 8 год. При обробці через 6 год проривний ріст був відсутнім, тоді як при обробці через 8 год відбувся проривний ріст E. coli (1/12) та S. pyogenes. Слід зазначити, що існує припущення, що в цих дослідженнях початкова кількість бактерій в КТ була низькою, але така ситуація не спостерігатиметься при бактеріємії у донора. Ситуація, звісно, рідкісна, але, безсумнівно, можлива (35). На додаток, різниця в кількості бактерій може залежати від методики дезінфекції шкіри руки донора, застосування чи не застосування методики злиття першої порції донорської крові, а також методики підготовки КТ, аферез чи РРС. Дані NHSBT свідчать про вірогідно вищий рівень забруднення при використанні методики РРС у порівнянні з аферезом (12). 

Якщо ІП обробка не проведена в належний час, кількість мікроорганізмів, що швидко розмножуються (зокрема патогенні грамнегативні мікроорганізми), може збільшитись до рівня, що перевищує здатність системи ІП до інактивації, що призведе до прориву. Мікроорганізми, що залишились, розмножуватимуться з часом, та призведуть до захворювань та смерті пацієнтів. Даними, отриманими за результатами автоматичного скринінгу зразків крові з використанням системи BacT/ALERT, безсумнівно продемонстровано, що користь таких систем, зокрема, полягає у виявленні патогенних грамнегативних мікроорганізмів, що швидко розмножуються (12).  І навпаки, ці системи не є оптимальними для виявлення мікроорганізмів, що розмножуються повільно, або мікроорганізмів з тривалою лаг-фазою (наприклад, грампозитивних мікроорганізмів, характерних для шкіри), що може призводити до хибно-негативного результату перевірки чи відкликання матеріалу з лікарні внаслідок виявлення пізніше. При використанні ІП систем обробку слід проводити так рано, як це можливо за операційною процедурою. Це необхідно для запобігання досягнення екзо- та ендотоксинами концентрації, яка теоретично може спричинити шкоду пацієнтові. Ефекти цих токсинів будуть наявні незалежно від життєздатності бактерій. ІП системи найкраще використовувати для обробки ТК, отриманого методом аферезу, з урахуванням потенційно коротшого інтервалу між часом отримання та обробкою, а бактеріальний скринінг є доцільним при отриманні ТК методом РРС. 

Висновок

Ефективність інактивації, забезпечувана системою Інтерсепт, перевищує ефективність інактивації системи Мірасол. З нашої точки зору, найбільш правильним методом для оцінки ІП систем є здатність до інактивації (термінальна стерильність), а не оцінка зменшення кількості бактерій одразу після обробки методом підрахунку в чашках. Методика ІП є альтернативою бактеріальному скринінгу, якщо обробка проведена в належний час, від якого залежать інактиваційні можливості системи.

Будьте в курсі новин

    A