Эффективность двух коммерчески доступных систем для инактивации патогенов (ИП) в тромбоцитарных компонентах крови (ТК) – Мирасол и Интерсепт – оценивалась через анализ отсутствия жизнеспособных бактерий во всем содержании ТК в конце срока его годности.
Методы. Был применен метод пул-энд-сплит (объединенные образцы донорской крови, затем разделены) с двумя обработанными образцами и одним необработанным контрольным образцом на засев каждой из концентраций. В пары пакетов с ТК засевали по одному виду бактерий. Три концентрации (n = 2 для каждой из концентраций), с десятикратным увеличением, первоначально были проверены на основе данных, опубликованных изготовителем. В зависимости от полученных результатов, концентрацию, которую проверяли в дальнейшем, увеличивали или уменьшали, вплоть до определения способности системы обеспечивать инактивацию. Количество бактерий оценивали после добавления, сразу перед обработкой (через два часа после добавления), сразу после обработки и на этапе завершения срока хранения (день седьмой). Обогащение культуры осуществляли непосредственно перед обработкой, после обработки и на этапе завершения срока хранения.
Результаты. Эффективность инактивации, в КОЕ/мл, систем Интерсепт и Мирасол, соответственно, на этапе истечения срока хранения ТК была следующей: Staphylococcus aureus ≥ 107, < 101; Staphylococcus epidermidis ≥ 106, < 102; Klebsiella pneumoniae 105, < 101; Streptococcus bovis ≥ 107, 101, Escherichia coli ≥ 106, <101; Streptococcus pneumoniae ≥ 106, 103; Streptococcus mitis ≥ 107, 101; Listeria monocytogenes ≥ 107, < 101; Streptococcus dysgalactiae ≥ 107, < 101; Serratia marcescens 103, < 101; Pseudomonas aeruginosa 103, систему Мирасол не проверяли; и Bacillus cereus < 102, систему Мирасол не проверяли.
Заключение. Эффективность инактивации системой Интерсепт была выше Мирасол. Эффективность инактивации (обеспечение терминальной стерильности) является важнейшей оценкой системы ИП по показателям уничтожения бактерий, чем оценка логарифмического снижения содержания бактерий в чашках сразу после обработки. ИП предоставляет альтернативу проверке на содержание бактерий, если обработка проведена в надлежащее время с учетом способности системы обеспечивать инактивацию
Ключевые слова: бактерии, безопасность крови, инактивация патогенных микроорганизмов; тромбоцитарный компонент.
Передача бактерий при трансфузиях крови остается существенной проблемой трансфузионной медицины. В Великобритании по схеме «Серьезные опасности, ассоциированные с трансфузией» (SHOT), в пределах надзора за безопасностью переливания крови, было зафиксировано 44 случая заражения бактериями во время трансфузии за период с 1996 по 2018 год, переливание тромбоцитарного компонента (ТК) становило 84% от всех случаев (1). Сообщено об 11 смертях: два случая – после переливания эритроцитарной массы и девять – ТК. В Германии 124 случая заражения бактериями были подтверждены за период с 1997 по 2017 год, из них 72 – при трансфузии ТК, 47 – эритроцитарной массы и пять – при переливании свежезамороженной плазмы. Зарегистрировано 17 случаев смерти: 13 – после переливания ТК и четыре – эритроцитарной массы (2 – 5).
Отделом переливания крови и трансплантации NHS (NHSBT) было инициировано проведение исследования в 1999 году для оценки уровня бактерий и идентификации выявленных микроорганизмов в ТК и эритроцитарной массе. Были проверены образцы ТК и эритроцитарной массы по истечении срока хранения. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что в примерах были обнаружены представители микрофлоры кожи (6). С использованием результатов NHSBT были проведены дальнейшие исследования для оценки эффективности ряда мер по уменьшению риска контаминации компонентов крови. В частности, было усовершенствовано дезинфекцию кожи рук донора (7), а первые 30 мл крови сливались и не попадали в пакет для сбора крови (8). Перечисленные меры являются чрезвычайно эффективными для уменьшения контаминации. Дополнительная обработка кожи донора и слияние обеспечили снижение загрязнения на 57% и 47% соответственно (8). В комбинации эти два процесса обеспечили снижение на 77%. NHSBT ввел практику слияния в 2002 году, а усовершенствованную дезинфекционную обработку кожи руки донора – в 2005 году. До внедрения этих мер, в период 1995 – 2001 годов, NHSBT было зарегистрировано, в общей сложности, 23 инцидента передачи (включая пять случаев с летальным исходом). Из них 20 случаев при переливании ТК (четыре летальных исхода) и 3 при переливании эритроцитарной массы (один летальный случай) (9). После внедрения этих мер, в период с 2006 по 2010 год, было зарегистрировано 10 случаев бактериальной передачи, включая 4 случая с летальным исходом. Семь из этих случаев произошли при переливании ТК, из них 3 с летальным исходом (10). Также было зарегистрировано 5 случаев, когда загрязнение ТК было обнаружено по результату визуальной проверки перед трансфузией. Этот период совпадал с увеличением сообщений о нежелательных явлениях, обусловленных внедрением директивы ЕС в 2005 году, в которой обозначено, что сообщения о явлениях являются обязательными, а не добровольными (11).
Бактериальный скрининг всех образцов ТК был внедрен NHSBT в 2011 году как мера для дальнейшего снижения риска. Для проверки применялась автоматическая система обнаружения микроорганизмов ВасТ/ALERT 3D (bioMerieux Ltd, Дарем, Северная Каролина, США) (12). Это вмешательство оказалось успешным, поскольку после его внедрения до сих пор был зарегистрирован один подтвержденный и один подозреваемый случай передачи и четыре несостоявшихся случая на более 2,4 млн проверенных образцов ТК без случаев с летальным исходом (1).
Мирасол (Terumo BCT, Лейквуд, Колорадо, США) и Интерсепт (Cereus Corporation, Конкород, Калифорния, США) являются единственными системами для инактивации патогенных микроорганизмов (ИП), которые коммерчески доступны в Великобритании и являются потенциальной альтернативой бактериальному скринингу. Обе системы предотвращают репликацию ДНК/РНК, хотя механизмы их действия различны. Система Интерсепт основана на фотохимическом методе, в ней используется амотосален. Этот синтезированный псорален проникает через клеточные и ядерные мембраны и связывает двуспиральные участки ДНК и РНК. УФ свет низкой энергии (320 – 400 нм) активирует амотосален, связывающий нуклеиновые кислоты, а, следовательно, блокирует репликацию ДНК/РНК. В данной системе используется композитный абсорбционный прибор (КАП) для удаления остатков амотосалена и продуктов фотосинтеза (13). Система Мирасол основана на использовании рибофлавина (витамин В2), действующего в качестве фотосенсибилизатора. Под влиянием УФА и УФВ света (280-400 нм) он опосредует селективное повреждение нуклеиновых кислот без связывания с клетками или белками. Рибофлавин связывается с нуклеиновыми кислотами и опосредует независимый от кислорода переход электронов, что влечет за собой необратимое повреждение нуклеиновых кислот. Поскольку рибофлавин является природным витамином и продукты его распада под влиянием света считаются нетоксичными, этап удаления остатков этого процесса не нужен (14).
Задачей нашего исследования была оценка эффективности систем Мирасол и Интерсепт обеспечивать инактивацию определенных бактерий. Инактивация была определена как отсутствие жизнеспособных бактерий на этапе истечения срока хранения с обогащением культуры (терминальная стерильность). Во многих исследованиях ИП, проведенных до сих пор (например в исследовании Lin и соавторов, 2004 года), эффективность инактивации бактерий оценивали по показателю логарифмического уменьшения, то есть по оценке снижения концентрации бактерий непосредственно после обработки по сравнению с концентрацией к обработке, что, по нашему мнению, является неподходящей методикой (15).
В исследовании был использован метод пул-энд-сплит для создания гомогенных образцов ТК для проверки каждого из исследованных видов бактерий. Для проверки содержания бактерий одного вида использовали по два мешка, которые подвергали обработке, и один контрольный мешок, к которым добавляли бактерии этого вида в каждой из исследованных концентраций (Рис. 1). В начале были проверены три концентрации (n = 2 для каждой из концентраций), с десятикратным увеличением и с учетом данных, опубликованных производителем (16, 17). Диапазон концентраций зависел от вида проверяемых бактерий. В зависимости от полученных результатов концентрацию, которую проверяли в дальнейшем, увеличивали или уменьшали, вплоть до определения способности системы обеспечивать инактивацию. Все образцы оставляли на два часа после добавления для уравновешивания бактерий в среде мешка перед ИП обработкой. Все мешки с образцами, использованные для анализа, хранили при постоянном встряхивании при температуре 22 ± 2°С, за исключением периодов взятия из них образцов и обработки. Количество бактерий в каждом из образцов определяли методом посева в агаре после добавления, немедленно перед обработкой, немедленно после обработки и на этапе завершения семидневного срока хранения тромбоцитов. Обогащение культуры с использованием системы ВасТ/ALERT осуществляли во все временные точки, за исключением точки после добавления.
Эффективность инактивации для каждого из проверенных микроорганизмов была определена системой как наибольшая концентрация (КОЕ/мл) бактерий, для которой было обнаружено отсутствие размножения жизнеспособных бактерий при обогащении среды в обоих аналогичных образцах ТК на этапе завершения срока хранения (терминальная стерильность). Для сравнения, для оценки стерильности использовали также и метод подсчета в чашках на этапе завершение срока хранения. Наивысшую концентрацию (КОЕ/мл) для каждого из видов бактерий, которая могла быть инактивирована до стерильности, определяли также сразу после обработки (со сравнительной целью), методом подсчета в чашке и с обогащением культуры, в двух флаконах (аэробные и анаэробные условия).
Рис. 1 Схематическое изображение методики оценки эффективности систем для инактивации патогенных микроорганизмов.
Использованные клинически значимые штаммы были получены путем бактериальной трансмиссии (БТ), бактериального скрининга (БС), из одного зараженного образца и обнаружены при визуальной инспекции (ВИ). Один изолят был получен из Американской коллекции типичных культур (ATCC) (LGC Standards, Теддингтон, Великобритания).
Для проверки систем Мирасол и Интерсепт были использованы следующие десять видов микроорганизмов: Staphylococcus aureus (ВІ), Staphylococcus epidermidis (БТ), Klebsiella pneumonia (BT), Streptococcus bovis (БТ), Escherichia coli (БТ), Streptococcus pneumonia (БТ), Streptococcus mitis (ATCC 6249), Listeria monocytogenes (БС), Streptococcus dysgalactiae (БС) и Serratia marcescens (БС). Два дополнительных микроорганизма были обработаны системой Интерсепт, поскольку имелись дополнительные мешки для обработки: Pseudomonas aeruginosa (БС) и Bacillus cereus (БТ, вегетативна форма). Ни один из производителей ИП систем не предоставлял гарантий по инактивации бактериальных спор, которые могут образовывать такие виды, как Bacillus и Clostridium.
Для исследования использовали цельную кровь из лейкотромбоцитарного слоя, ТК из комбинированного образца (ТКК) и из образцов, полученных от давших согласие доноров, с добавлением в первый день периода хранения (на следующий день после получения донации). Проведение исследования было одобрено комитетом по этике. Тромбоциты были суспендированы в среде с примерно 65% SSP + дополнительный раствор тромбоцитов (PAS) (Macopharma, Муво, Франция) и 35% плазмы, производимой согласно спецификации, которую рекомендовал производитель ИП систем (18, 19).
Для получения гомогенных образцов до начала анализа ТК (n = 9) из всех донаций были объединены и в дальнейшем распределены по три аналогичных образца на серию: по одной серии на каждую концентрацию для каждого из исследованных видов микроорганизмов (диапазон: 255 – 325 мл для системы Интерсепт, 250 – 450 мл для системы Мирасол). Два образца из трех были предназначены для обработки, а третий использовали в качестве контрольного образца, который не предоставлялся обработке.
Стерильный соединительный элемент (B Braun Ltd, Шеффилд, Великобритания) был установлен с соблюдением асептических условий: в порт каждого мешка из ТК, для посева бактерий и дальнейшего получения образцов.
Культуры микроорганизмов были подготовлены из криоконсервированных образцов в чашках с колумбийским кровяным агаром с добавлением 5% лошадиной крови (Oxoid Ltd, Бейсингсток, Великобритания) для оценки жизнеспособности и подтверждения наличия представителей выбранного вида. Суспензию (0,5 – 1,0 МакФарланд), примерно 108 КОЕ/мл, готовили в стерильном 0,85% солевом растворе, с последующим приготовлением серийных десятикратных разведений для получения надлежащей концентрации бактерий. Были приготовлены по два образца суспензий трех финальных концентраций и затем высеяны в чашки с агаром для оценки количества засеянных бактерий. Чашки инкубировали в аэробных условиях в течение 24 часов при температуре 35±2°С.
Бактерии в соответствующей концентрации засевали в мешки с ТК через установленный связующий элемент. При этом использовали стерильный гипотермический шприц, трижды промытый в ТК.
Все образцы ТК, за исключением контрольных, обрабатывали через два часа после посева. Весь персонал получил должное обучение и был аттестован производителем для использования соответствующей ИП системы. Для обработки были выбраны система Набор Интерсепт для обработки малых объемов тромбоцитов (INT 21). Продолжительность КАП этапа составляла 13,7 – 15,5 часа. Для обработки системой Мирасол были использованы одноразовые наборы Mirasol® Platelet Disposable Kit в PAS (10790).
Обогащенные культуры были подготовлены из маточного образца, полученного методом пул-энд-сплит, и проверены системой BacT/ALERT 3D (bioMerieux) для подтверждения поиска бактерий перед добавлением. Осуществляли добавление двух типов микроорганизмов (распределение по необходимости в атмосферном кислороде, то есть аэробные и анаэробные).
Мешки из ТК также были проверены добавлением обогащенной культуры непосредственно перед началом освещения (по одному флакону с микроорганизмами каждого из типов по необходимости в атмосферном кислороде) и сразу после обработки (также по одному флакону для каждого из типов микроорганизмов). На седьмой день были подготовлены пары флаконов из всего остаточного содержимого мешков из ТК. Ко всем флаконам BacT/ALERТ, использованным в исследовании, с аэробными и анаэробными микроорганизмами, было засеяно по 8 мл с последующей инкубацией в системе BacT/ALERТ в течение семи дней при температуре 36 ± 1°С.
Содержимое всех флаконов BacT/ALERТ, отмеченных как положительные в период инкубирования, было пересеяно в чашки с колумбийским кровяным агаром с добавлением 5% лошадиной крови, для идентификации обнаруженных микроорганизмов. Для идентификаций видов были использованы системы Phoenix 100 или BBL Crystal (обе BD: Becton, Dickinson UK Ltd, Вокингхем, Великобритания).
Образцы получали также после добавления: для каждого из временных точек, для оценки содержимого методом использования подсчета в чашках. Была применима методика разравнивания шпателем «хоккейная клюшка». Объем образца составлял по 100 мкл/чашка, каждый из образцов был приготовлен серией из двух. Чашки инкубировали в течение минимум 24 часов, при температуре 35±2°С, после чего производили подсчет бактерий.
На Рис. 2 проиллюстрирована способность к инактивации микроорганизмов, проверенных в нашем исследовании, обеспечиваемая системами Интерсепт и Мирасол. Система Интерсепт обеспечивает большую эффективность инактивации микроорганизмов, проверенных в нашем исследовании, по сравнению с системой Мирасол. Все данные о возможностях инактивации и стерильности приведены в десятых степенях.
Рис. 2 Сравнение способности к инактивации систем Интерсепт и Мирасол. *Способность ≥ определена наибольшая концентрация. †Способность≤ определена самая низкая концентрация (<102 КОЕ/мл для В. cereus и S. Epidermidis; < 101 КОЕ/мл для других видов).
На Рис. 3 проиллюстрирована высокая концентрация (КОЕ/мл) для каждого из видов микроорганизмов, проверенных в нашем исследовании. Их инактивация к состоянию стерильности может быть обеспечена системой Интерсепт сразу после обработки и на этапе завершения срока годности. За исключением P. aeruginosa и S. marcescens, уровень инактивации к стерильности был идентичным как при определении сразу после обработки, так и в день седьмой. Для P. aeruginosa и S. marcescens, уровень инактивации снижался с 102 до 101 КУО/мл в день седьмой: оценка происходила методом подсчета в чашке. Для обогащения культуры S. marcescens снижение способности к инактивации на этапе завершения срока хранения составляло 101 КУО/мл.
Рис. 3 Сравнение показателей уровня инактивации к стерильности сразу после обработки и после завершения срока хранения. Система Интерсепт. *Уровень инактивации ≥ определена наибольшая концентрация. †Уровень инактивации ≤ определена самая низкая концентрация (102 КОЕ/мл).
На Рис. 4 приведено сравнение наибольших концентраций (КОЕ/мл) для каждого из видов проверенных бактерий, которые могут быть инактивированы до стерильности при использовании системы Мирасол (сразу после обработки и в седьмой день). Для всех микроорганизмов отмечено снижение уровня стерильности в седьмой день по сравнению с показателем, определенным сразу после обработки (101 до 105 КОЕ/мл). Оценка производилась методом подсчета в чашке. Что касается обогащенной культуры, снижение способности к инактивации составило, по крайней мере, 101 КОЕ/мл для всех видов (за исключением S. mitis и S. marcescens).
Рис. 4 Сравнение показателей уровня инактивации к стерильности, сразу после обработки и после завершения срока хранения. Система Мирасол. *Уровень инактивации ≥ определена наибольшая концентрация. †Уровень инактивации ≤ определена самая низкая концентрация (102 КОЕ/мл для S. Epidermidis; < 101 КОЕ/мл для других видов).
На Рис. 5 показано количество бактерий, определенное методом подсчета в чашках: до обработки, непосредственно после обработки и по истечении срока хранения (при использовании системы Мирасол). Концентрация первичного сложения составляла 103 КОЕ/мл. Перед обработкой целевая концентрация составляла порядка 103 КОЕ/мл. Сразу после обработки бактерии обнаружены не были, а на седьмой день не было обнаружено размножение всех проверенных микроорганизмов (за исключением одного образца из серии S. Epidermidis и в обоих образцах серии S. pneumoniae). В обогащенной культуре были обнаружены все организмы после обработки по меньшей мере в одном из образцов серии (за исключением S. aureus, S. pneumoniae и S. epidermidis).
Рис. 5 Количество бактерий до обработки в системе Мирасол, концентрация бактерий 103 КОЕ/мл, сразу после обработки и после завершения срока хранения (день 7), оценка методом подсчета в чашках. После обработки размножение ниже границы обнаружения для всех видов.
Системой Интерсепт продемонстрирована большая эффективность инактивации всех микроорганизмов по сравнению с системой Мирасол (Рис. 2). В нашем исследовании концентрация бактерий, инактивацию к стерильности которых обеспечивала система Интерсепт, была больше, чем при использовании системы Мирасол, по результатам проверки сразу после обработки и после окончания срока хранения ТК (терминальная стерильность, Рис. 3 и 4). Эти результаты совпадают с данными Kwon и соавторов, полученными в исследовании с непосредственным сравнением, в отличие от проведенного нами исследования. Логарифмическое снижение, обнаруженное Kwon и соавторами, с использованием систем Мирасол и Интерсепт составило: E.coli 5,45 по сравнению с 9,22; S. aureus 4,26 по сравнению с ≥ 10,11 и B. cereus 5,09 по сравнению с 7,74 соответственно (20). Причина разницы между эффективностью инактивации систем Мирасол и Интерсепт неизвестна и требует проведения дальнейших исследований. Возможно, это обусловлено разностью способности к проникновению активных веществ, применявшихся в каждой из систем (рибофлавин и амотосален), через бактериальную стенку, дозу света и/или применение света с разной длиной волны.
Уровень инактивации к стерильности при использовании системы Интерсепт (немедленно после обработки и после окончания срока хранения) был одинаковым для всех видов, за исключением P. aeruginosa и S. marcescens. Оценка производилась методом подсчета в чашках (Рис. 3). Способность к терминальной активации, обеспечиваемая системой Интерсепт, равнялась или превышала наибольшую из оцененных концентраций (106 – 107 КОЕ/мл), для всех видов, за исключением K. pneumoniae (105 КОЕ/мл), P. aeruginosa (103 КОЕ/мл), S. marcescens (103 КОЕ/мл) и B. cereus (< 102 КОЕ/мл).
Уровень инактивации к стерильности при использовании системы Мирасол (немедленно после обработки) был существенно ниже для всех проверенных видов (диапазон 101 – 105 КОЕ/мл). Оценка производилась методом подсчета в чашку (Рис. 4). При проверке способности к инактивации, определяемой методом обогащения культуры, этот эффект был менее отчетлив.
Логарифмическое уменьшение при оценке сразу после обработки (оценка методом подсчета в чашках) не является надлежащим показателем для оценки способности ИП системы к инактивации бактерий вследствие потенциального размножения остаточных неинактивированных бактерий, которые со временем могут размножаться до потенциально патогенного уровня. Это проиллюстрировано на Рис. 5 данными, полученными в исследовании, когда бактерии в концентрации 103 КОЕ/мл были добавлены к КТ (индивидуальное добавление 10 видов микроорганизмов) и образцы были обработаны в системе Мирасол. Размножение не было обнаружено по результатам проверки сразу после сложения (метод подсчета в чашках) при использовании всех исследованных микроорганизмов, что соответствует логарифмическому снижению ≥ 3,0. Также на седьмой день было обнаружено существенное увеличение (105 – 109 КОЕ/мл) содержания всех проверенных микроорганизмов (метод подсчета в чашках), за исключением S. pneumoniae и одного из образцов из серии S.epidermidis. Jacobs и соавторы, по результатам исследования, задачей которого была оценка бактериальной концентрации, способной вызвать тяжелую, но не летальную реакцию после трансфузии, утверждают, что соответствующая концентрация составляет 105 КОЕ/мл (21). Такой же феномен был обнаружен при использовании системы Интерсепт, при добавлении P. aeruginosa и S. marcescens в концентрации 104 КОЕ/мл, когда размножение не было обнаружено немедленно после обработки, но на этапе истечения срока годности было обнаружено прорывное увеличение. По нашему выводу, терминальная стерильность на этапе истечения срока хранения является оптимальным методом оценки способности ИП системы уничтожать бактерии. Это значение выражали в КОЕ/мл в нашем исследовании, тогда как логарифмическое уменьшение является безразмерным параметром, следовательно, является открытым для толкования. Тип мешка, объем и среда для приготовления суспензии могут также влиять на эффективность инактивации. Следует подчеркнуть, что каждая система тщательно проверена с использованием обогащенной культуры, поскольку остаточное содержание в каждом мешке с тромбоцитами проверяли системой BacT/ALERT, что, насколько нам известно, не осуществляли ни в одном исследовании.
Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что способность к инактивации бактерий зависит от вида, а также от проверенного штамма, что было продемонстрировано в других исследованиях, и может объяснять разногласия уровня инактивации, установленные нами и указанные производителем (Рис. 2) (22, 23). Это подчеркивает необходимость валидации ИП системы с использованием большого количества видов и штаммов бактерий.
Ни один из производителей не заявлял способности к инактивации спор, образуемых такими микроорганизмами, как Bacillus cereus и Clostridium perfringens. Споры являются «Ахиллесовой пятой» всех имеющихся в настоящее время ИП систем. Для сравнения, недостатком систем для скрининга бактериальных культур является неспособность выявлять медленно размножающиеся бактерии или бактерии с длительной лаг-фазой, поскольку количество бактерий может быть недостаточным для обнаружения во взятом образце. Передачи, включая случаи с летальными исходами, вызванные бактериями, которые образуют споры (один из таких случаев произошел при использовании ИП NHSBT для внедрения бактериального скрининга), описаны в литературных источниках (24 – 26). Они произошли при использовании КТ не обработанного ИП. Маловероятно, что такие микроорганизмы могут присутствовать в КТ только в вегетативной форме. Лишь три спорообразующих бактерии были подтверждены NHSBT за период с февраля 2011 по декабрь 2019 года, по результатам скрининга 2,4 млн. КТ. То есть, частота составляет 1 на 800 000 КТ (персональное общение с Su Brailsford). В Соединенных Штатах представителями Bacillus было представлено около 1,4% всех бактерий, обнаруженных при проведении стандартного бактериального скрининга, они стали причиной одной из 68 септических реакций после внедрения обязательного скрининга в 2004 году (25, 27). Недавно в Соединенных Штатах умерли два пациента после переливания ТК: были обнаружены Clostridium perfringens (28). Бактериальный посев был произведен через 24 часа после получения донорской крови, но анаэробный флакон, являющийся оптимальным методом обнаружения анаэробных микроорганизмов, не использовали. Управлением контроля пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) опубликовано официальное руководство в связи с этой проблемой: введено позднее время для взятия образца и обязательное использование анаэробного флакона (29). Бактериальный скрининг является методом-заменителем проверки эритроцитарной массы, ассоциированной с объединенными образцами ТК, полученными NHSBT, что не обеспечивается ИП (30).
Время обработки чрезвычайно важно для успешного применения ИП системы. Wagner и соавторы, а также Schmidt и соавторы в независимо проведенных исследованиях продемонстрировали, что при добавлении низкой концентрации в системе Интерсепта возможен прорывной рост K. pneumoniae, если обработка не проведена вовремя (23, 31). Wagner и соавторы продемонстрировали прорывной рост в одном образце из серии из трех, с добавлением малого количества бактерий (7 – 9 КОЕ/мешок), через 30 часов, но не через 24 часа, хотя другой штамм K. pneumoniae был полностью инактивирован в обе временные точки, свидетельствующие о вариации штамма. Был обнаружен прорывной рост в день пятого срока хранения, концентрация составляла 1 х 109 КОЕ/мл, что является потенциально угрожающей для жизни концентрацией этого грамотрицательного микроорганизма.
Связь между эффективностью инактивации и временем обработки заключается в том, что чем больше способность системы к инактивации, тем больше может быть время обработки. Время до обработки должно основываться на кинетике размножения микроорганизмов, способность инактивации (обеспечение терминальной стерильности) которых самая низкая, а также на кинетике размножения микроорганизмов, способных к быстрому размножению. В случае системы Интерсепт, по данным нашего исследования, такими микроорганизмами являются P. aeruginosa и S. marcescens. Надлежащее время для ИП является критическим фактором максимального повышения безопасности. Чем меньше продолжительность периода между получением донорской крови и обработкой, тем выше уровень безопасности. Данные исследования свидетельствуют о том, что обработку с применением системы Мирасол следует проводить сразу для обеспечения максимальной пользы, тогда как обработку с применением системы Интерсепт можно проводить гораздо позже после донации, что обеспечивает большую операционную гибкость. Максимальное время до обработки, заявленное компанией Церус (Cerus) при использовании системы Интерсепт в Европе, составляет: до конца дня при использовании методов афереза и РРС для подготовки ТК и при семидневном сроке хранения ТК (18). В Соединенных Штатах система Интерсепт является единственной лицензированной FDA для обработки ТК, полученного методом афереза. Обработка должна быть проведена в течение периода ≤24 часа после донации, а срок хранения составляет пять дней (32). На чем основывается указанное время до обработки, неизвестно, впрочем в работе Wagner и соавторов, а также Schmidt и соавторов, задан вопрос о времени до обработки с использованием систем Интерсепт, отличного от рекомендованного в Соединенных Штатах (23, 32). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что семидневный срок хранения безопасен, хотя необходимы дальнейшие исследования для валидации времени до обработки и использования клинических данных, полученных в Европе, при хранении в течение семи дней.
Terumo BCT утверждает, что при использовании системы Мирасол, полученный методом афереза ТК следует обрабатывать в период от двух до 22 часов после донации; методом РРС – в течение 8 часов после получения или ≤ 32 часов после донации (19). В исследовании, проведенном Terumo BCT, в котором обработку проводили через два часа после добавления в ТК, индивидуально, 13 микроорганизмов (20 штаммов), прободный рост наблюдали в зависимости от концентрации начального добавления (22). Данные исследования свидетельствуют о том, что система Мирасол не является 100% эффективной даже при минимальной продолжительности периода до обработки при начальном добавлении микроорганизмов в низкой концентрации (< 20 КОЕ/образец).
В системе Макофарма Терафлекс УФ используют свет УФ спектра С, без добавления химических веществ, в отличие от систем Мирасол и Интерсепт (33). В настоящее время проводятся клинические исследования системы Терафлекс, она не является коммерчески доступной. Эта система является единственной, для которой были опубликованы данные, полученные для множества микроорганизмов, на которых основывается продолжительность периода до обработки. Эксперименты с добавлением были проведены с использованием 14 референсных штаммов ВОЗ, которые добавляли в ТК индивидуально, в концентрации 45 – 285 КОЕ/образец. Для каждого из проверенных микроорганизмов была использована серия из 12 идентичных образцов (34). ИП обработка была проведена через 6 и 8 часов. При обработке через 6 часов прободный рост отсутствовал, тогда как при обработке через 8 ч произошел прорывной рост E. coli (1/12) и S. pyogenes. Следует отметить, что существует предположение, что в этих исследованиях начальное количество бактерий в КТ было низким, но такая ситуация не будет наблюдаться при бактериемии у донора. Ситуация, конечно, редкая, но, несомненно, возможна (35). В дополнение, разница в количестве бактерий может зависеть от методики дезинфекции кожи руки донора, применения или не применения методики слияния первой порции донорской крови, а также методики подготовки КТ, аферез или РРС. Данные NHSBT свидетельствуют о вероятно более высоком уровне загрязнения при использовании методики РРС по сравнению с аферезом (12).
Если ИП обработка не проведена в надлежащее время, количество быстро размножающихся микроорганизмов (в том числе патогенные грамотрицательные микроорганизмы) может увеличиться до уровня, превышающего способность системы ИП к инактивации, что приведет к прорыву. Оставшиеся микроорганизмы будут размножаться со временем и приведут к заболеваниям и смерти пациентов. Данными, полученными по результатам автоматического скрининга образцов крови с использованием системы BacT/ALERT, несомненно продемонстрировано, что польза таких систем, в частности, заключается в выявлении быстро размножающихся патогенных грамотрицательных микроорганизмов (12). И наоборот, эти системы не являются оптимальными для обнаружения медленно размножающихся микроорганизмов или микроорганизмов с длительной лаг-фазой (например, грамположительных микроорганизмов, характерных для кожи), что может приводить к ложно-отрицательному результату проверки или отзыву материала из больницы вследствие обнаружения позже. При использовании ИП систем обработку следует проводить так рано, как это возможно по операционной процедуре. Это необходимо для предотвращения достижения экзо- и эндотоксинами концентрации, которая теоретически может нанести вред пациенту. Эффекты этих токсинов будут присутствовать независимо от жизнеспособности бактерий. ИП-системы лучше всего использовать для лечения ОК, полученных аферезом, учитывая потенциально более короткий интервал между временем получения и обработки, а бактериальный скрининг более уместен при получении ОК методом РРС.
Эффективность инактивации, обеспечиваемая системой Интерсепт, превышает эффективность инактивации системы Мирасол. С нашей точки зрения, наиболее правильным методом оценки ИП систем является способность к инактивации (терминальная стерильность), а не оценка снижения численности бактерий сразу после обработки путем подсчета в чашках. Метод ИП является альтернативой бактериальному скринингу, если лечение проводится в соответствующее время, от которого зависят инактивационные возможности системы.
В данной статье приведены результаты исследования эффективности двух коммерчески доступных систем для инактивации патогенов: Мирасол и Интерсепт.
* Источник: оригинальная статья Vox Sanguinis. Международное общество трансфузии крови
* Автор-корреспондент: Carl McDonald, Microbiology Services Laboratory – Bacteriology, NHS Blood and Transplant, Charcot Road, London, NW9 5BG, U.K.