ICSI: короткий огляд методу і технічних вимог до мікроскопії

ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) – метод штучного запліднення, при якому один відібраний сперматозоїд вводять у яйцеклітину за допомогою ін’єкційної мікропіпетки, при цьому паралельно використовується утримувальна мікропіпетка для фіксації клітини. Ця процедура виконується вручну ембріологом із застосуванням мікроманіпуляторів та мікроінжектора, а контроль усіх етапів відбувається за допомогою мікроскопа.

ICSI застосовують у випадках, коли необхідний підвищений контроль запліднення або є фактори, що знижують ймовірність запліднення при стандартному IVF (In Vitro Fertizilation). Типові показання включають фактори безпліддя з боку чоловіка (низька концентрація сперматозоїдів, їх слабка рухливість, аномальна морфологія), використання кріоконсервованого матеріалу, а також ситуації з попередніми невдалими заплідненнями при класичному підході. Остаточний вибір методу визначається результатами репродуктивних обстежень жінки та чоловіка, клінічним протоколом та внутрішніми стандартами лабораторії.

ICSI належить до процедур, де результат залежить від точності рухів, стабільності інструментів, якості візуалізації та здатності відтворювати налаштування в однаковому вигляді між робочими змінами та ембріологами. Крім того, із розвитком методу з’явилися різні його варіації. 

1. Якщо потрібна детальна селекція сперматозоїдів щоб виключити будь-які морфологічні аномалії та вибрати найбільш придатний сперматозоїд, тоді використовують IMSI (Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection). Вибір сперматозоїда таким методом досягається використанням максимального збільшення оптики мікроскопа та подальшого цифрового збільшення.
2. Іншим методом для селекції сперматозоїдів є PICSI (Physiologically Selected Introcytoplasmatic Sperm Injection). Методика полягає у тому, що ембріолог наносить сперматозоїди на середовище із гіалуроновою кислотою, таким чином імітуючи природні умови, за яких сперматозоїди взаємодіють із мембраною ооцита, отже можна відібрати максимально цілісні та рухливі з них.
3. Ще однією варіацією процедури є Piezo-ICSI. Замість гострої піпетки зі сперматозоїдом, яка пробиває мембрану ооцита, в цьому методі сперматозоїд набирають у негостру пласку піпетку, яка потім підводиться до мембрани і піддається мікровібраціям від п’єзо-елемента із дуже високою частотою. Завдяки цьому піпетка може м’яко та нетравматично проникнути через мембрану клітини, що може бути більш безпечним, тому що не відбувається грубого механічного пошкодження оболонки.

Методика ICSI – ооцит, утримувальна піпетка, ін’єкційна піпетка зі сперматозоїдом

ICSI виконується на мікроманіпуляційній станції, де всі компоненти мають працювати як єдина система. Типова конфігурація включає прилади, які представлені нижче

Інвертований мікроскоп 

Мікроскоп визначає якість візуалізації та стабільність роботи. У практичному сенсі для ICSI важливі:

• стабільна механіка та плавне фокусування
• можливість застосовувати контрастні методи для прозорих зразків
• достатній робочий простір і зручність встановлення маніпуляторів
• цифрова камера

Для мікроманіпуляцій необхідний доступ до зразка зверху, оскільки мікропіпетки та тримачі маніпуляторів підводяться до чашки або спеціального посуду зверху. Інвертований мікроскоп має об’єктиви під зразком, що забезпечує вільний робочий простір над зразком для встановлення та роботи маніпуляторів. Така конструкція також зручна для роботи з культуральним посудом із прозорим дном і для тривалих маніпуляцій із живими клітинами.

Порівняння прямого та інвертованого мікроскопа для мікроманіпуляцій

Leica DMi8 – інвертований мікроскоп, який найкраще підходить як базова платформа для ICSI-станції та роботи з клітинами.

Мікроманіпулятори

Маніпулятори забезпечують точні рухи мікропіпеток в декількох осях. Критичні параметри:

• мінімальний люфт і відсутність дрейфу
• стабільна фіксація тримачів піпеток
• зручний доступ до регулювань у робочій позі лікаря

Narishige – японські мікроманіпуляційні системи, які легко інтегруються в архітектуру мікроскопа і дають стабільне, надточне позиціонування.

Мікроінжектор

Інжектор відповідає за керування тиском у піпетці. Практично важливі:

• відтворюваність подачі імпульсу
• передбачуваність параметрів утримання та ін’єкції
• зручність керування без відриву від робочого процесу

Антивібраційна основа

Будь-які вібрації погіршують контроль кінчика піпетки та стабільність зображення. Для ICSI важливо мінімізувати вібраційний вплив від підлоги, столу та навколишнього обладнання.

Підігрів та аксесуари для підтримки температури

Рішення можуть включати модулі із нагрівальним столиком, камери-інкубатори, підігрів повітрям згори, що дозволяє утримувати стабільну температуру в робочій зоні. Надійне рішення від наших партнерів – термостолики TohaiHit для стабільного підтримання температури під час маніпуляцій, щоб зберігати фізіологічні умови та життєздатність клітин.

ICSI-станція з інвертованим мікроскопом Leica DMi8 і маніпуляторами Narishige

Ооцити та сперматозоїди є прозорими об’єктами з низькою природною контрастністю. Для коректної роботи застосовують режими, що підвищують видимість структур без фарбування. Фазовий контраст покращує видимість прозорих об’єктів і широко застосовується для живих клітин. У контексті ICSI фазовий контраст може спростити контроль меж клітинних структур і положення інструмента. Через природу оптичних ефектів фазовий контраст сумісний із скляним посудом для зразка. Хофманівський модульований контраст також використовується для контрастування прозорих об’єктів, і завдяки природі методу утворює псевдорельєф, що полегшує роботу із окремими об’єктами. Хофманівський контраст сумісний із пластиковим посудом.

Окремим важливим пунктом у контрастуванні є можливість побачити веретено поділу в ооциті (spindle observation contrast). Веретено поділу – це структура всередині ооцита, що відповідає за коректне дозрівання клітини та за рівномірний розподіл хромосом на етапі поділу. Можливість побачити веретено поділу дозволяє провести процедуру ICSI більш безпечно, аби під час ін’єкції не пошкодити цю структуру. Рішення контрасту веретена поділу базуються на поляризаційному методі, оскільки він дозволяє бачити структури, які мають різні напрямки відбиття світла.

Візуалізація веретена поділу за допомогою системи HamiltonThorne Oosight, чорно-білий контраст

HamiltonThorne Oosight – система візуалізації веретена поділу, яка підсилює контроль під час маніпуляцій і допомагає працювати з клітиною максимально делікатно.

У деяких випадках існують показання до проведення процедури допоміжного хетчингу ембріона (від hatch – вилуплення). Лазерний хетчинг – це методика, коли за допомогою коротких лазерних імпульсів навмисно пошкоджують зовнішню оболонку ооцита, аби допомогти ембріону вийти з оболонки та прікріпитися до стінки матки. Зазвичай методику радять жінкам, які в минулому перенесли невдалі спроби ЕКЗ, жінкам старшого віку, а також при різній морфології клітини, як-от занадто товста оболонка.

Фото попереднього вибору області та успішної роботи лазера, виконано за допомогою лазера HamiltonThorne Lykos DTS

Lykos DTS від HamiltonThorne – лазерний модуль для допоміжного хетчингу, що додає контрольовану та швидку обробку оболонки ембріона під задачі ембріологічної лабораторії.

ICSI є процедурою, що вимагає точного керування та постійного візуального та температурного контролю. Отже, з позиції мікроскопії основні вимоги до оснащення IVF-лабораторії для ICSI можна сформулювати так:

• інвертований мікроскоп із достатнім робочим простором для мікроманіпуляторів
• режими контрасту для прозорих живих зразків
• стабільна механіка, плавне керування та відтворюваність
• рішення для підтримки температури в робочій зоні
• використання цифрової камери для збільшень та контрасту окремих стуктур клітин

Рішення для станції ICSI ідеально закриває інвертований мікроскоп Leica DMi8. Завдяки зручній архітектурі мікроскоп можна дооснастити мікроманіпуляційними системами Narishige із точною японською механікою, передовим лазером HamiltonThorne Lykos DTS для допоміжного хетчингу, а також ефективною системою візуалізації веретена HamiltonThorne Oosight. Для контролю температур і забезепечення життєздатності клітин в систему можна додати термостолики від TohaiHit, а для захисту від зовнішніх факторів систему можна розмістити на антивібраційній поверхні. Модульність контрукції, ергономічне поєднання всіх компонентів системи та преміальна якість оптики та механіки зроблять станцію ICSI бездоганним інструментом на багато років.