ICSI: краткий обзор метода и технических требований к микроскопии

ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) — метод искусственного оплодотворения, при котором один отобранный сперматозоид вводится в яйцеклетку с помощью инъекционной микропипетки, при этом параллельно используется удерживающая микропипетка для фиксации клетки. Процедура выполняется вручную эмбриологом с применением микроманипуляторов и микроинжектора, а контроль всех этапов осуществляется с помощью микроскопа.

ICSI применяют в случаях, когда необходим повышенный контроль оплодотворения или присутствуют факторы, снижающие вероятность успеха при стандартном IVF (In Vitro Fertilization). Типичные показания включают мужской фактор бесплодия (низкая концентрация сперматозоидов, сниженная подвижность, аномальная морфология), использование криоконсервированного материала, а также ситуации с предыдущими неудачными попытками оплодотворения при классическом подходе. Окончательный выбор метода определяется результатами репродуктивных обследований женщины и мужчины, клиническим протоколом и внутренними стандартами лаборатории.

ICSI относится к процедурам, где результат напрямую зависит от точности движений, стабильности инструментов, качества визуализации и способности воспроизводить одинаковые настройки между рабочими сменами и разными эмбриологами. Кроме того, по мере развития метода появились различные его вариации.

1. Если требуется детальная селекция сперматозоидов для исключения любых морфологических аномалий и выбора наиболее пригодного сперматозоида, используют IMSI (Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection). Отбор сперматозоидов при этом методе достигается за счёт использования максимального оптического увеличения микроскопа с последующим цифровым увеличением.

2. Другим методом селекции сперматозоидов является PICSI (Physiologically Selected Intracytoplasmic Sperm Injection). Методика заключается в нанесении сперматозоидов на среду с гиалуроновой кислотой, тем самым имитируя природные условия взаимодействия сперматозоидов с мембраной ооцита. Это позволяет отобрать наиболее зрелые и функционально полноценные сперматозоиды.
3. Ещё одной вариацией процедуры является Piezo-ICSI. В отличие от классического подхода с острой пипеткой, пробивающей мембрану ооцита, в этом методе сперматозоид набирают в тупоконечную плоскую пипетку. Пипетка подводится к мембране и подвергается микровибрациям от пьезоэлемента с очень высокой частотой. Благодаря этому пипетка может мягко и нетравматично проникать через мембрану клетки, что считается более безопасным, поскольку отсутствует грубое механическое повреждение оболочки.

Методика ICSI – ооцит, удерживающая пипетка, инъекционная пипетка со сперматозоидом

Процедура ICSI выполняется на микроманипуляционной станции, где все компоненты должны работать как единая система. Типовая конфигурация включает следующие элементы.

Инвертированный микроскоп

Микроскоп определяет качество визуализации и стабильность работы. С практической точки зрения для ICSI важны:

• стабильная механика и плавная фокусировка

• возможность применения контрастных методов для прозрачных образцов

• достаточное рабочее пространство и удобство установки манипуляторов

• цифровая камера

Для микроманипуляций необходим доступ к образцу сверху, так как микропипетки и держатели манипуляторов подводятся к чашке или специальной посуде именно сверху. Инвертированный микроскоп имеет объективы, расположенные под образцом, что обеспечивает свободное рабочее пространство над образцом для установки и работы манипуляторов. Такая конструкция также удобна для работы с культуральной посудой с прозрачным дном и для длительных манипуляций с живыми клетками.

Сравнение прямого и инвертированного микроскопа для микроманипуляций

Leica DMi8 — инвертированный микроскоп, который оптимально подходит в качестве базовой платформы для ICSI-станции и работы с клетками.

Микроманипуляторы

Манипуляторы обеспечивают точные движения микропипеток по нескольким осям. Критически важные параметры:

• минимальный люфт и отсутствие дрейфа

• стабильная фиксация держателей пипеток

• удобный доступ к регулировкам в рабочей позе врача

Narishige — японские микроманипуляционные системы, которые легко интегрируются в архитектуру микроскопа и обеспечивают стабильное, сверхточное позиционирование.

Микроинжектор

Инжектор отвечает за управление давлением в пипетке. Практически важны:

• воспроизводимость подачи импульса

• предсказуемость параметров удержания и инъекции

• удобство управления без отвлечения от рабочего процесса

Антивибрационная основа

Любые вибрации ухудшают контроль кончика пипетки и стабильность изображения. Для ICSI крайне важно минимизировать вибрационное воздействие со стороны пола, стола и окружающего оборудования.

Подогрев и аксессуары для поддержания температуры

Решения могут включать нагреваемые столики, камеры-инкубаторы, воздушный подогрев сверху, что позволяет поддерживать стабильную температуру в рабочей зоне. Надёжным решением от наших партнёров являются термостолики TohaiHit, обеспечивающие стабильное поддержание температуры во время манипуляций для сохранения физиологических условий и жизнеспособности клеток.

ICSI-станция с инвертированным микроскопом Leica DMi8 и манипуляторами Narishige

Ооциты и сперматозоиды являются прозрачными объектами с низкой естественной контрастностью. Для корректной работы применяются режимы, повышающие видимость структур без окрашивания.

Фазовый контраст улучшает визуализацию прозрачных объектов и широко используется при работе с живыми клетками. В контексте ICSI фазовый контраст упрощает контроль границ клеточных структур и положения инструмента. По своей оптической природе фазовый контраст совместим со стеклянной посудой для образцов.

Контраст Хоффмана (Hoffman Modulation Contrast) также применяется для контрастирования прозрачных объектов и за счёт формирования псевдорельефа облегчает работу с отдельными структурами. Контраст Хоффмана совместим с пластиковой лабораторной посудой. Отдельно следует отметить возможность визуализации веретена деления в ооците (spindle observation contrast). Веретено деления — внутренняя структура ооцита, ответственная за правильное созревание клетки и равномерное распределение хромосом в процессе деления. Возможность визуализации веретена деления позволяет выполнить процедуру ICSI более безопасно, избегая повреждения этой структуры во время инъекции. Такие решения основаны на поляризационном методе, позволяющем визуализировать структуры с различной ориентацией отражения света.

Визуализация веретена деления с помощью системы HamiltonThorne Oosight, чёрно-белый контраст

HamiltonThorne Oosight — система визуализации веретена деления, усиливающая контроль во время манипуляций и позволяющая работать с клеткой максимально деликатно.

В ряде случаев существуют показания к проведению процедуры вспомогательного хетчинга эмбриона (от англ. hatch — вылупление). Лазерный хетчинг — методика, при которой с помощью коротких лазерных импульсов намеренно ослабляют внешнюю оболочку эмбриона, чтобы облегчить его выход и имплантацию в стенку матки.

Как правило, метод рекомендуется женщинам с предыдущими неудачными попытками ЭКО, женщинам старшего репродуктивного возраста, а также при определённых морфологических особенностях, например при чрезмерно толстой оболочке.

Фото предварительного выбора области и успешной работы лазера, выполнено с помощью лазера HamiltonThorne Lykos DTS

Lykos DTS от HamiltonThorne — лазерный модуль для вспомогательного хетчинга, обеспечивающий контролируемую и быструю обработку оболочки эмбриона в условиях эмбриологической лаборатории

ICSI — процедура, требующая точного управления, постоянного визуального и температурного контроля. С точки зрения микроскопии основные требования к оснащению IVF-лаборатории для ICSI можно сформулировать следующим образом:

• инвертированный микроскоп с достаточным рабочим пространством для микроманипуляторов

• контрастные режимы для прозрачных живых образцов

• стабильная механика, плавное управление и воспроизводимость настроек

• решения для поддержания температуры в рабочей зоне

• использование цифровой камеры для увеличения и повышения контраста отдельных клеточных структур

Оптимальным решением для ICSI-станции является инвертированный микроскоп Leica DMi8. Благодаря удобной архитектуре микроскоп может быть дооснащён микроманипуляционными системами Narishige с точной японской механикой, современным лазером HamiltonThorne Lykos DTS для вспомогательного хетчинга, а также эффективной системой визуализации веретена HamiltonThorne Oosight. Для температурного контроля и поддержания жизнеспособности клеток в систему можно интегрировать термостолики TohaiHit, а для защиты от внешних воздействий — разместить станцию на антивибрационной поверхности. Модульность конструкции, эргономичное сочетание всех компонентов и премиальное качество оптики и механики делают ICSI-станцию надёжным инструментом на долгие годы.