Рідинна хроматографія

Рідинна хроматографія – це метод поділу різних хімічних сполук, який передбачає розчинення іонів або молекул зразка. Рідинна хроматографія (ЖХ) здійснюється в колоні, на папері, або в тонкому шарі сорбенту. У першому випадку зразок проходить чергування з нерухомою фазою, що складається з частинок неправильної або сферичної форми. Через відмінності в іонообміні, адсорбції і розмірі різні розчинені речовини взаємодіють зі стаціонарною фазою по-різному. З цієї причини час проходження речовин через колону і загальний час дослідження може істотно відрізнятися. Колонна газорідинна хроматографія передбачає, що при проходженні рідкої рухомої фази через колону досліджувані речовини взаємодіють з нерухомою (стаціонарної) фазою. Ці взаємодії засновані на відмінності показників:
адсорбованості компонентів суміші в конкретному адсорбенті (рідинно-адсорбційна хроматографія);
розчинності сорбатів різних фазах (розподільна хроматографія);
іонообмінної рівноваги (іонообмінна хроматографія);
розчинності опадів у рухомій фазі (осадова хроматографія);
проникності молекул поділюваних речовин в нерухому фазу (ексклюзивна хроматографія).

Крім того, дані взаємодії можуть ґрунтуватися на біоспецифічній взаємодії компонентів з афінним лігандом (афінна хроматографія). Під час процесу поділу взаємодія між рухомою фазою і досліджуваними сполуками змінюється. Вони розподіляються між стаціонарною і рухомою фазами. Потім кожне з'єднання елююуєтся з колонки в певному порядку в залежності від відносної сили його взаємодії.

Рухома фаза (елюат) продовжує текти через колону, і потім збирається у фракції з різною концентрацією, які формують хроматограму. Режим виявлення змінюється залежно від виявленого аналіту. При застосуванні колонкової рідинної хроматографії для розділення білків концентрація білка контролюється вручну за допомогою барвника. Однак такий ручний контроль є досить трудомістким.

Високоефективна рідинна хроматографія

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) являє собою один з видів колонної хроматографії, при якій пробна суміш (аналіт) в розчиннику (рухома фаза) закачується в колону з хроматографічним матеріалом (стаціонарна фаза) під високим тиском. Зразок при цьому переноситься рухомим потоком газу-носія, в ролі якого виступає гелій або азот. ВЕРХ – це надійний спосіб розділяти і ідентифікувати сполуки, присутні в будь-якому зразку, який може бути розчинений в рідині в концентраціях до 1/1012. Завдяки такій універсальності метод ВЕРХ широко застосовується в науці і промисловості, зокрема у фармацевтиці, екології, криміналістиці та хімічній промисловості. Зокрема, нерідко можна зустріти використання ВЕРХ у фармацевтичному аналізі.

Основна мета застосування ВЕРХ-методу – ідентифікація, кількісне визначення та очищення конкретного аналіту або з'єднання. ВЕРХ-системи дозволяють проводити як кількісний, так і якісний аналіз. ВЕРХ можна використовувати в наступних областях:
очищення води;
ідентифікація домішок у фармацевтичній промисловості;
попередня концентрація мікроелементів;
лигандообменная хроматографія;
іонообмінна хроматографія білків;
аніонообмінна хроматографія вуглеводів і олігосахаридів з високим рівнем рН.

Час утримання зразка в колоні варіюється в залежності від сили взаємодії між нерухомою фазою, аналізованими молекулами, а також розчинником або набором розчинників. У момент проходу через колону зразок взаємодіє між двома фазами з різною швидкістю, головним чином через різну полярність аналізованих речовин. Речовини, які мінімально взаємодіють зі стаціонарною фазою і максимально з рухомою, будуть залишати колону швидше.

Переваги

Серед основних переваг систем високоефективної рідинної хроматографії верх відзначають наступні:
управління та автоматизація приладів для хроматографії, зокрема, управління даними, функціями безпеки, а також звітністю та обслуговуванням приладів;
потужність і швидка адаптованість до різних завдань;
підвищена продуктивність шляхом управління всіма областями аналізу.

Прилади

Основні компоненти системи ВЕРХ включають один або кілька резервуарів для розчинника, помпа високого тиску, саму колону, інжекторну систему і детектор. Резервуар містить розчинник (рухома фаза). Зазвичай в системі є як мінімум два резервуари, кожен з яких вміщує до 1000 см² розчинника і забезпечений газовим дифузором, який дозволяє барботувати гелій. Помпа використовується для створення потоку рухомої фази. Хоча ручна ін'єкція зразків залишається доступною опцією, більшість ВЕРХ-систем зараз повністю автоматизовані й управляються за допомогою комп'ютера. Інжектор (автоматичний пробовідбірник) вводить розчинник у фазовий потік, який переносить пробу в колону високого тиску (до 400 барів), зі спеціальним матеріалом, необхідним для здійснення поділу (стаціонарна фаза). Детектор використовується для ідентифікації смуг розділеної речовини в момент елюації. Інформація передається з детектора на комп'ютер, який генерує хроматограму.

Рухома фаза виходить з детектора і або відправляється у відходи, або збирається за бажанням. Ефективним методом дегазації рухомої фази є розпорошення гелію. У випарному детекторі розсіювання світла (ELSD) в якості розпилюючого газу також використовується азот.