Обладнання для хроматографічного аналізу

Хроматографічний метод – це важливий біофізичний метод дослідження, який дозволяє розділяти, ідентифікувати та очищати компоненти суміші для якісного та кількісного аналізу.

Хроматографія передбачає відділення молекул суміші, нанесеної на поверхню або у тверде тіло, в ході руху в рідкій нерухомій (стаціонарної фазі). На інтенсивність процесу поділу впливають молекулярні характеристики, пов'язані з адсорбцією (рідина-тверде тіло), поділом (рідина-тверде тіло) і спорідненістю або відмінностями між їх молекулярними масами. Через ці відмінності деякі компоненти суміші довше залишаються в нерухомій фазі і повільно переміщаються в хроматографічній системі, в той час, як інші швидко переходять в рухому і швидше її залишають. Основи хроматографії складають три компоненти:
стаціонарна фаза, шар рідини, адсорбованої на поверхні твердої опори;
рухома фаза, рідкий або газоподібний компонент;
окремі молекули досліджуваної речовини.

Хроматографічний аналіз проявив себе як ефективний метод поділу та ідентифікації малих молекул, таких як амінокислоти, вуглеводи та жирні кислоти. Хроматографічна класифікація включає, зокрема, афінну (іонообмінну) хроматографію, яка більш ефективна при поділі макромолекул (нуклеїнові кислоти й білки). Площинна (планарна, паперова і тонкошарова) хроматографія використовується для поділу білків і в дослідженнях, пов'язаних з їх синтезом. Газорідинна хроматографія використовується для розділення спирту, ефірів, ліпідів і аміногруп і спостереження ферментативних взаємодій, в той час, як молекулярно-ситова хроматографія використовується для визначення молекулярних мас білків. Нарешті, гель-хроматографія (гель-фільтрація) використовується для очищення РНК, частинок ДНК і вірусів.

Основною метою застосування хроматографії є ефективне розділення речовин протягом відповідного тимчасового інтервалу. З цією метою були розроблені колонкова (КХ) та тонкошарова (ТШХ) хроматографія, паперовий, газовий та іонообмінний хроматографічні методи, а також гель-хроматографія, осадова хроматографія, рідинна хроматографія високого тиску та афінна хроматографія. Крім поділу хроматографія може використовуватися в якості методу кількісного аналізу речовини.

Колонкова хроматографія

Колонкова хроматографія (нерухома фаза знаходиться на колоні), зокрема, є одним з найпоширеніших методів очищення білків. Процедура дозволяє визначити такі характеристики білків, як розмір і форма, загальний заряд, гідрофобні групи на поверхні та ступінь взаємодії зі стаціонарною фазою. На колону (нерухома фаза) наноситься відокремлюваний зразок і промивний буфер (рухома фаза). Спеціальний механізм забезпечує їх проходження через внутрішній матеріал колони, розміщений на склопластикової опорі. Залежно від температури та обсягу зразки скупчуються в нижній частині пристрою.

Іонообмінна хроматографія

Іонообмінна хроматографія базується на електростатичних взаємодіях між зарядженими білковими групами та твердим матеріалом-носієм (матрицею). Матриця має іонне навантаження, протилежне навантаженню відокремлюваного білка, тяжіння білка до колонки досягається за допомогою іонних зв'язків. Білки відокремлюються від колонки шляхом зміни рН, концентрації іонних солей, або іонної сили буферного розчину. Позитивно заряджені іонообмінні матриці називаються аніонообмінними матрицями та адсорбують негативно заряджені білки. У той час як матриці, пов'язані з негативно зарядженими групами, відомими як катіонообмінні матриці, адсорбують позитивно заряджені білки.

Газова хроматографія

Газова хроматографія являє собою простий, високочутливий і швидкий метод для ефективного поділу найдрібніших молекул. Він використовується при поділі дуже малих кількостей аналізованих речовин. При цьому методі стаціонарна фаза являє собою колону, рухома фаза – інертний газ, який пропускається через неї під високим тиском. Аналізований зразок випаровується і переходить в газоподібну рухливу фазу. Компоненти, які містяться в зразку, диспергують між рухомою і нерухомою фазами на твердому носії.

Тонкошарова хроматографія

Тонкошарова (твердорідинна адсорбційна) хроматографія передбачає використання в якості стаціонарної фази тверду поглинальну речовину, нанесену на скляні пластини. Рухома фаза переміщається через нерухому вгору по тонкій пластині за допомогою капілярного ефекту. Разом з нею вгору переміщається суміш досліджуваної речовини, її компоненти переміщаються з різною швидкістю, яка залежить від полярності матеріалу, використовуваної твердої фази та розчинника. Таким чином досягається поділ аналітів.

Якщо молекули зразка безбарвні, для визначення їх положення на хроматограмі можуть бути використані флуоресценція, радіоактивність або певна хімічна речовина. Утворення видимого кольору можна спостерігати при кімнатному освітленні або ультрафіолетовому світлі. Положення кожної молекули в суміші можна виміряти, розрахувавши співвідношення між відстанями, пройденими молекулою і розчинником. Це значення вимірювання називається відносною рухливістю і виражається символом Rf, воно використовується для якісного опису молекул.