Визначення нітрозамінів у фармацевтичній продукції та сировині

Нітрозаміни – це молекули, які містять нітрозофункціональну групу та є добре відомими високомутагеними забруднювачами, що формуються реакцією вторинних амінів з нітритом у кислотних умовах.

Негативний вплив нітрозамінів вивчався роками. Відомо понад 300 їхніх видів, і більше ніж 90% з них демонструють канцерогеність на різних типах тварин. Вміст нітрозамінів контролюється у харчових продуктах, косметичних виробах, тютюнових виробах, розчинниках та алкогольних напоях. Їх відносять до 1 класу забруднювачів відповідно до вказівок ICH M7 (R1). Крім того, нітрозаміни є частиною сумнозвісної “cohort of concern“, разом із афлатоксиноподібними речовинами, азокси-сполуками та діоксинами.

Особливий ризик становить те, що нітрозаміни дуже легко формуються в результаті взаємодії вторинних або третинних амінів з анітрозувальним агентом, а нітрити або аміни можуть бути присутніми як ненавмисні забруднювальні речовини в сировині, реагентах та розчинниках, що використовуються під час виробничих процесів, і можуть призвести до утворення нітрозамінів у кінцевих лікарських продуктах.

Перший випадок виявлення нітрозамінів у лікарських засобах був зареєстрований у 2018 році. Препаратом, контамінованим NDMA (N-нітрозодиметіламін|) виявився валсартан, який внаслідок цього був відкликаний з ринку. З 2018 по середину 2020 року були відкликані ще понад 40 партій різних препаратів, переважно групи сартанів. Виникнення NDMA та NDEA у сартанах пов’язують з тим, що під час приготування як розчинники використовувались аміни або розчинники, що містили домішки амінів. Пізніше з’явились дані, що виникнення нітрозамінів може бути наслідком забруднення сировини, реагентів та розчинників.

Лідером 2020 року з кількості відкликань став метформін, а відкриттям – домішки нових нітрозамінів MNP та CPNP у ріфампіцині та ріфапентині. Наразі препарати відкликані не були, оскільки ризик для здоров’я пацієнтів, пов’язаний з їхнім відкликанням, перевищував потенційну небезпеку від забруднювачів.

Результатом моніторингу кількості нітрозамінів у лікарських препаратах стало жорстке регулювання їхнього вмісту та встановлення тимчасового значення добової дози для окремих домішок, наведеного у таблиці 1.

Таблиця 1 Тимчасові значення добової дози окремих домішок.

Ці ліміти застосовуються лише тоді, коли лікарський засіб містить лише один нітрозамін. Якщо більше ніж одна домішка з таблиці детектована, і загальна кількість домішок перевищує 26,5 нг/день, то необхідно повідомити про це регуляторні органи.

Допустимі межі споживання для нових нітрозамінів склали 0,16 частин на мільйон (ppm) для MNP у рифампініні та 0,1 ppm для CPNP у рифапентині.

Чому вказані значення тимчасові?

Тому що, згідно зі стратегією Європейської Фармакопеї ці ліміти діятимуть лише впродовж 2-річного перехідного періоду (до 1 квітня 2021 року), який дається на зміну виробничих процесів для зниження вмісту нітрозамінів. Препарати, що містять концентрації вищі за вказані, не можуть перебувати в обігу.

Після завершення перехідного періоду нітрозаміни мають бути відсутні у фармацевтичних препаратах. Рівні NDMA або NDEA у активних субстанціях мають «не піддаватись кількісному вимірюванню» після 1 квітня 2021 року.

Фактично, кінцева концентрація нітрозамінів, що допускається до квітня 2021 року вираховується з максимальної добової дози препарату та значення допустимої добової дози. Ось, наприклад, для максимальної добової дози препарату 1200 мг та допустимої добової дози у 26,5 мкг LOQ методу визначення має становити не більше ніж 0,02 мг/кг, або 20 ppb. Аналогічні розрахунки для NDMA у метформіні з добовою дозою 3000 мг та 96 мкг NDMA дають цифру у 30 ppb.

Якщо добова доза продукту становить менше 880 мг/день, то ліміт для сумарного вмісту нітрозамінів не має перевищувати 0,03 ppm

Згідно галузевого керівництва FDA, виробники АФІ та готових продуктів мають використовувати лише методи з LOQ ≤ 0,03 ppm, але при цьому треба зважати на те, що, наприклад, для того самого метформіну, після розведення препарату у розчиннику та підготовки зразку, кінцева концентрація NDMA у віалі не повинна перевищувати 1,6 ppb, що робить вимоги до чутливості методики визначення у готових препаратах значно жорсткішими, аніж це може здаватися на перший погляд. З іншого боку, відповідні розрахунки для сировини та розчинників навпаки – показують менші вимоги до чутливості визначення.

Були опубліковані рекомендації всім власникам ліцензій на продаж лікарських препаратів ,які коротко можна викласти так:

Компаніям рекомендовано провести такі кроки:

• Оцінити можливість присутності нітрозамінів в продукції протягом 6 місяців.
• Пріоритизувати оцінки, починаючи з лікарських засобів, які, ймовірно, мають ризик вмісту нітрозамінів.
• Взяти до уваги результати огляду CHMP щодо сартану.
• Повідомити регуляторні органи про результати оцінки ризику.
• Тестувати продукти з ризиком вмісту будь-яких нітрозамінів.
• Негайно повідомляти про виявлення нітрозамінів.

З 1го жовтня 2020 всі оператори фармацевтичного ринку повинні систематично включати оцінку ризиків стосовно потенційного виникнення нітрозамінів

Також 1 вересня 2020 року FDA опубліковала галузеву інструкцію для контролю вмісту нітрозамінових домішок у лікарських препаратах для людей, в якому розглядаються основні причини виникнення нітрозамінових домішок та надаються рекомендації всім виробникам лікарських препаратів.

Починаючи з 2018 року, багато міжнародних організацій працювали над надійними та чутливими методами визначення нітрозамінів у фармацевтичній продукції. Наразі Європейський директорат з якості лікарських засобів та охорони здоров’я опублікував низку методів, розміщених на їхньому сайті та розроблених Офіційними лабораторіями контролю лікарських засобів (OMCL) Загальноєвропейської мережі OMCL (GEON).

Підсумково вони наведені у таблиці 2.

Таблиця 2: Методики контролю, опубліковані мережею офіційних лабораторій контролю лікарських засобів (OMCL)

Як можна зауважити, більшість методів вже не відповідають вимогам з чутливості методів, зазначених у регуляторних вимогах.

FDA своєю чергою опубліковала низку рекомендованих методик для визначення нітрозамінів у фармацевтичних препаратах, наведених у таблиці 3.

Таблиця 3: Методики контролю нітрозамінів, опубліковані FDA

Їхня чутливість вже краща, але що раніше опублікований метод, то меншою є кількість нітрозамінів, включених до нього. Найбільш чутливим методом, який дає змогу аналізувати найбільшу кількість нітрозамінів (8 шт) – є метод 138617, який використовує мас-спектрометрію високої роздільної здатності, прилад типу орбітальна іонна пастка (Orbitrap).

Що каже європейська фармакопея?

Публікується нова загальна стаття про аналіз нітрозамінів – Аnalysis of N-nitrosamine impurities in active substances (2.4.36)

Основні домішки, що контролюються відповідно до неї (7 штук) – N-нітрозо-диметиламін (NDMA), N-нітрозо-діетиламін (NDEA), N-нітрозо-дибутиламін (NDBA), N-нітрозо-N-метил-4-аміномасляна кислота (NMBA); N-нітрозо-діізопропіламін (NDiPA), N-нітрозо-етил-ізопропіламін (NEiPA) та N-нітрозо-дипропіламін (NDPA). Чутливість аналізу за статтею – нижче 30 ppb. Використовуються методи ГХ/МС, ГХ/МС/МС та ВЕРХ/МС/МС, причому жоден з них не використовується для визначення всіх видів нітрозамінів. Найбільшу кількість компонентів за цією статтею визначає метод ГХ/МС/МС – 6, за ним йде ВЕРХ/МС/МС який застосовується відповідно до 5 видів домішок. Метод ГХ/МС використовується лише для аналізу NDMA та NDEA.

Компанія Thermo Scientific єдина, хто пропонує повний перелік обладнання відповідно до рекомендованих методів визначення нітрозамінів.

Метод газової хроматографії-мас-спектрометрії (ГХ/МС)

Найпростішим методом визначення двох основних нітрозамінів NDMA та NDEA є ГХ//МС з парофазним інжектуванням. Обидва вказані нітрозаміни є леткими сполуками, що добре переходять у парову фазу. При цьому підготовка проби, що вимагається для такого виду аналізу – наймінімальніша з можливих.

Межа кількісного визначення методу, що розроблений з використанням парофазного пробовідбірника Thermo Scientific TriPlus 500 HS, газового хроматографу Trace 1310 та одноквадрупольного мас-детектору ISQ™ 7000 становить 15 ppb для NDMA (LOD – 4 ppb) та 30 ppb для NDEA (LOD 9 ppb), що набагато краще, аніж межа кількісного визначення європейських методик та методик FDA, розроблених на аналогічному обладнанні інших виробників. При цьому таке рішення найбільш доступне за ціною, а парофазний автосамплер TriPlus 500 HS легко розширюється з базової конфігурації на 12 віал до рішення з максимально-доступною пропускною здатністю на 240 зразків.

Якщо перед вами стоїть завдання визначення лише двох зазначених основних нітрозамінів – рішення на базі ГХ/МС ISQ™ 7000 буде ідеальним за співвідношенням ціна-якість, та забезпечить чутливість на рівні останніх регуляторних вимог.

Метод газової хроматографії-та тандемної мас-спектрометрії (ГХ/МС/МС)

Розглядаючи методи з використанням тандемної мас-спектрометрії, ми маємо 2 можливості – парофазне інжектування для найлеткіших нітрозамінів та пряме рідинне інжектування з попередньою підготовкою проби для ширшого переліку компонентів в одному аналізі.

Парофазне інжектування усуває складність матриці, що призводить до зниження фонового шуму та поліпшення селективності. При цьому підготовка проби залишається мінімальною. Компанією Thermo Scientific опублікований метод визначення 4 нітрозамінів (NDMA, NDEA, NDIPA, NEIPA) за допомогою мас-детектору TSQ™ 9000 з парофазним пробовідбірником TriPlus 500 HS. Він є аналогічним методу 124025 від FDA, але з лімітом кількісного визначення від 2 до 10 ppb та лімітом детектування 2 ppb, що від 5 до 20 разів чутливіший за метод FDA, розроблений на аналогічному обладнанні інших виробників. Використання запатентованих технологій VPI та NeverVent також забезпечує мінімальний час, необхідний на заміну колонки чи обслуговування джерела, що в поєднанні з неперевершеною ємністю парофазного автосамплеру TriPlus 500 HS дає можливість отримати найбільшу доступну пропускну здатність приладу.

Переходячи до методів з прямим рідинним інжектуванням, ми стикаємося з більшим впливом компонентів матриці, що роблять методику складнішою та вимагають ретельної підготовки проби. Метод, опублікований компанією Thermo на мас-детекторі TSQ™ 9000 з рідинним інжектуванням для 5 нітрозамінів, дає ліміт кількісного визначення від 0,5 до 1 ppb та ліміт детектування від 0,2 до 0,5 ppb, що значно перевищує вимоги до максимального вмісту нітрозамінів та ліміту кількісного визначення методу.

Засобами покращення чутливості та розширення переліку нітрозамінів, що визначаються методом ГХ/МС/МС є:

1) Використання твердофазного екстрагування (ТФЕ).
2) Використання SPME (твердофазного мікроекстрагування).
3) Використання дисперсивного твердофазного екстрагування (dТФЕ).
4) М’якша іонізація (для іонізації електронним ударом (ЕІ) та невеликих молекул можлива фрагментація до невеликих іонів, визначенню яких може заважати фоновий шум).

При цьому використання SPME (твердофазного мікроекстрагування) легко автоматизується за допомогою автоматичного роботизованого самплеру TriPlus RSH, що зменшує влив людського фактору на якість підготовки зразків, збільшує чутливість та забезпечує неперевершену відтворюваність аналізу.

Метод рідинної хроматографії з тандемним мас-спектрометричним детектуванням

Коли ми використовуємо рідинну хроматографію з мас-спектрометричним детектуванням для кількісного визначення мінімальних кількостей контамінантів – ретельна підготовка проб є неминучою. На мас-спектрометричних детекторах виробництва компанії Thermo розроблений метод, що включає лише 4 етапи підготовки проби – подрібнення таблетки, екстрагування струшуванням у водному розчині, центрифугування та фільтрування зразка.

LOQ метод визначення NDMA (леткого та складного для визначення рідинною хроматографією компоненту) на найменш чутливому з сучасної лінійки тандемних квадрупольних мас-детекторів становить 0,3 мкг/кг. Користувачами Thermo з Індії та Кореї опубліковані методики на визначення 6 та 11 нітрозамінів в одному аналізі. При цьому чутливість методик склала від 0,25 до 1 ppb абсолютної концентрації, що значно перевищує дані опублікованих методів, розроблених на аналогічному обладнанні інших виробників.

Варто зазначити, що рекомендований метод іонізації для забезпечення задовільної чутливості визначення найбільш леткого компоненту – NDMA – Хімічна іонізація за атмосферного тиску. Різниця в чутливості між стандартною іонізацією електроспреєм (ESI) та використанням APCI в середньому – приблизно в 3 рази. Для інших компонентів тип іонізації не є таким принциповим.

ВЕРХ/МС/МС метод є обов’язковим, якщо одним з компонентів, які потрібно визначати, є NMBA. Зважаючи на фізико-хімічні властивості вказаного нітрозаміну, визначати його газовою хроматографією не рекомендується. Для всіх інших нітрозамінів, що контролюються відповідно до нової фармакопейної статті, можна використовувати ГХ/МС/МС методику.

Метод рідинної хроматографії з мас-спектрометричним детектуванням високої роздільної здатності приладом типу орбітальна іонна пастка

Чому FDA розробило 5 методів з використанням детектору Orbitrap, незважаючи на задовільні результати з використанням тандемного мас-детектування?

Найчастіше джерелом нітрозамінів є АФІ. Кожен препарат має свої властивості, що впливають на ефективність підготовки проби. Крім того, готові лікарські препарати є досить складною матрицею, яка містить велику кількість компонентів, що заважають аналізу. Іноді нітрозаміни виходять майже одночасно з піком АФІ, іноді піки інтерференцій спотворюють кількісні результати щодо нітрозамінів. Використання мас-спектрометрії високої роздільної здатності дає змогу ефективно розділяти нітрозаміни від АФІ або інтерференцій навіть для найскладніших зразків, тоді як унікальний дизайн орбітальної пастки забезпечує чутливіть не гірше, ніж у тандемних квадрупольних детекторів. Це робить Orbitrap ідеальним вибором для типів аналізу, що вимагають одночасно і надефективного розділення, і чутливості на рівні нанограмів.

Метод, опублікований на моделі Orbitrap Exploris 120 , що була анонсована у 2020 році, забезпечує ефективне розділення 7 нітрозамінів у концентрації 0,1 нг/мл з RSD за 3 інжекціями між 0 та 3,36%. Для порівняння, попередня модель Q-Exactive забезпечувала чутливість на рівні 0,5 нг/мл з RSD по 10 інжекціям між 0,76 та 1,62%.

Використання мас-детекторів високої роздільної здатності типу Orbitrap є ідеальним вибором для мультикомпонентного аналізу з високою чутливістю для найскладніших матриць. Відповідно до методик FDA цим методом можна контролювати всі 7 нітрозамінів, що контролюються відповідно до поточних регуляторних вимог. Це єдиний метод, опублікований для визначення 6 нітрозамінів у лікарських препаратах в цілому, без прив’язування до конкретного типу лікарського засобу. Щодо останніх доданих до контролю нітрозамінів MNP та CPNP – наразі опублікований метод тільки з детектуванням детектором типу Orbitrap.

Програмне забезпечення для збору даних та обробки результатів

Кожна фармацевтична лабораторія, що замислюється над використанням методів, складніших за одноквадрупольне мас-детектування, стикається з тим, що в кожного виробника для триквадрупольного детектування розроблене окреме програмне забезпечення, яке чудово працює зі складними алгоритмами оброблення даних та створення мас-спектрометричних методик, але, на жаль, не цілком відповідає регуляторним вимогам до програмного забезпечення. Ба більше, повноцінне підключення таких детекторів, управління ними, зберігання методик та обробка результатів у мережевих системах, що забезпечують цілісність даних у фармацевтичних лабораторіях – неможливе.

Компанія Thermo Fisher Scientific – єдина компанія, що спромоглася розробити програмне забезпечення, яке повною мірою відповідає всім регуляторним вимогам, в змозі управляти складними мас-спектрометричними детекторами, однаково ефективно та безпечно управляє та зберігає дані звичайних хроматографів й тандемних мас-детекторів.

Програмне забпезпечення Chromeleon CDS – більше ніяких компромісів!

Безпечне зберігання даних, збереження всіх версій результатів, відслідковування та зручний перегляд всіх змін, повна інтеграція в мережеву систему Chromeleon CDS. Розділення ролей та доступу користувачів, автоматичне та повне ведення аудиторського журналу – все це ви отримуєте в одному програмному пакеті навіть з тандемними мас-спектрометричними детекторами, без необхідності засвоєння нових програм та інтерфейсів.