Конфокальна мікроскопія. Знайдіть важливі деталі зразка за допомогою швидкого огляду!

Більше не потрібно передивлятись зображення за зображенням для візуалізації всього зразка – швидко знаходьте область інтересу за допомогою конфокального мікроскопа.

Ця стаття допоможе Вам в налаштуванні автоматичного отримання зображень з високою роздільною здатністю за допомогою шаблонів для предметних скелець, чашок Петрі та багатолункових планшетів. Програмне забезпечення LAS X Navigator – потужний інструмент навігації в платформі STELLARIS. Це свого роду GPS для клітин у зразку, що показує користувачам чіткий напрямок для отримання високоякісних даних. LAS X Navigator дає змогу поєднувати експерименти з конфокальним та флуоресцентним періодом на одному предметному столику та робить всі інструменти TauSense доступними для використання.

Ось кілька причин, чому користувачі можуть швидко отримати повний огляд своїх зразків, щоб знайти області інтересу (ROI), а потім легко отримати зображення з високою роздільною здатністю за допомогою програмного забезпечення LAS X Navigator.

Швидка орієнтація на зразок

Пошук добре промаркованих клітин у чашці Петрі чи конкретній області у великому зрізі тканини мозку може бути дуже важким і часовитратним. Причина в тому, що багато біологічних зразків набагато більші, ніж максимальне поле зору мікроскопа. Саме тому користувачам буває складно зрозуміти, яке саме місце зразку вони зараз переглядають.

Можна швидко налаштувати огляд зразка перед вибором областей інтересу (ROI) для подальших досліджень за допомогою функції спірального сканування LAS X Navigator. Це дозволяє користувачам лише в один клік отримати мозаїчне сканування, відцентроване відносно поточного поля зору.

Відео 1. Швидке спіральне сканування великого зразка для огляду перед вибором потрібної області. Приклад надано доктором Карлосом Сакрістаном Лопесом, Університет Хубрехта, Утрехт, Нідерланди.

Працюйте без проблем з масштабами різних розмірів

Хоча користувачі хочуть отримати зразок загалом, вони також зацікавлені в тому, щоб побачити найдрібніші деталі. Це означає, що ви повинні плавно перемикатися між масштабами різних розмірів.

Користувачі можуть швидко перемикатися між різними об’єктивами за допомогою програмного забезпечення LAS X Navigator та сканувати зразок із відповідним рівнем деталізації.

При зміні об’єктива автоматично перераховуються всі відповідні параметри, пов’язані з розміром та положенням зразка. Більше того, функція перегляду може показувати накладання відразу кількох записів, у тому числі отриманих за допомогою різних об’єктивів. Таким чином, користувачі можуть безперешкодно досліджувати зразок у різних масштабах, спочатку отримуючи поверхневий огляд, а потім переглядаючи дрібні деталі з кількох областей інтересу довільної форми з використанням z-стеків високої роздільної здатності.

Відео 2. Збільшення та сканування деталей зразка після зміни об’єктива. Приклад надано доктором Карлосом Сакрістаном Лопесом, Університет Хубрехта, Утрехт, Нідерланди.

Залишайтеся у фокусі на великих зразках та під час таймлапс записів

Користувачам може знадобитися відобразити великий зразок повністю, наприклад, зріз тканини або ж відсканувати багатолунковий планшет. При проведенні подібних експериментів можна часто зіткнутися з недоліком біологічних зразків та посуду із зондами – вони не ідеально плоскі. Ці геометричні дефекти, а також зсуви зразка під час довгого таймлапс відеозапису, призводять до проблем у фокусуванні.

Існує кілька способів компенсувати ці проблеми за допомогою програмного забезпечення LAS X Navigator. Він має інтуїтивно зрозумілий спосіб створення так званої «карти фокусування», визначаючи вручну або автоматично довільну кількість точок фокусування для інтерполяції відповідної позиції z. Крім того, оскільки «Adaptive Focus Control» (AFC) повністю інтегровано в програмне забезпечення, доступний неінвазивний швидкий підхід для утримання зразка у фокусі протягом тривалого періоду часу.

Мал. 1. LAS X Navigator може визначити довільну кількість точок фокусування для побудови карти фокусування.

Статистична вибірка та редактор випробування

Коли користувачі хочуть провести декілька маніпуляцій одночасно і разом з тим отримати статистично значущі результати, логічним вибором буде робота з багатолунковим планшетом для більшої кількості експериментів. Налаштування подібних експериментів вручну стомлює та зменшує продуктивність, оскільки для кожної окремої лунки необхідно вручну отримати кілька позицій для зображення.

При використанні редактора випробувань (Assay editor – ліцензія доступна окремо) програмного забезпечення LAS X Navigator, стає доступним широкий вибір звичайних носіїв зондів, таких як предметні скельця, чашки та багатолункові планшети.

Користувачі просто вибирають правильний носій та спосіб статистичного аналізу кожної лунки. Таким чином вони можуть швидко налаштувати STELLARIS для отримання значущих результатів. Замість використання стандартного носія, користувачі можуть налаштувати власний носій.

Мал. 2.  Два приклади стандартних носіїв із редактора випробувань.

Інтегрована зшивка зображень та їх аналіз

Отримання високоякісних даних є важливим, але на цьому етапі експеримент ще не завершений. Користувачам все ще потрібно зшити скани окремих фрагментів та виконати аналіз зображення. З цією метою програмне забезпечення LAS X Navigator полегшує такі робочі процеси: після отримання зображення можна автоматично об’єднувати окремі фрагменти з використанням обраного алгоритму зшивки. Також, функції обробки модуля 3D-аналізу (ліцензія доступна окремо) повністю інтегровані у програмне забезпечення для підтримки всього робочого процесу. Наприклад, послідовність обробки можна використовувати для характеристики щойно записаних клітинних ядер, тобто для їх сегментації, підрахунку, вимірювання їх розміру і т.д.

Мал. 3.  Модуль 3D-аналізу зшитих зображень із LAS X Navigator.

Об’єднання зображень для інтеграції інформації із зовнішніх зображень

Іноді користувачі отримують зображення не тільки за допомогою конфокального мікроскопа, як-от STELLARIS, але й за допомогою інших систем візуалізації. Звичайно, вони хочуть об’єднати ці дані. Зображення з різних джерел можна імпортувати та вирівнювати за допомогою програмного забезпечення LAS X Navigator.

Користувачі просто вибирають зображення, які вони хочуть імпортувати в програмне забезпечення, і використовують його панель інструментів для швидкого вирівнювання зображень. Таким чином, навіть знімок з камери смартфона можна використовувати для визначення ROI та їх автоматичного сканування.

Мал.4: LAS X Navigator імпортує та вирівнює конфокальні зображення із зображеннями з інших джерел, наприклад, знімком із камери.

Інтеграція зображень на основі часу життя флуоресценції (TauSense і FALCON)

Іноді користувачам необхідно розділити флуорофори, що спектрально перекриваються, зменшити небажані внески в сигнал або вивчити зміни в мікросередовищі. У той час як інформація про візуалізацію на основі інтенсивності, як і раніше, є найбільш використовуваним параметром для флуоресцентної мікроскопії, багато хто навчився цінувати візуалізацію на основі часу життя флуоресценції.

Мал. 5. Ідентифікація різних структур у поперечному перерізі аскариди. Поєднання інформації про час життя флуоресценції та інтенсивність флуоресценції із застосуванням предметного столика дає додатковий шар контрасту, що дозволяє розрізняти різні структури. LAS X Navigator дозволяє безперешкодно виконувати це завдання на всьому зразку.

З оригінальною статтею ви можете ознайомитися на сайті нашого партнера  Leica Microsystems.

Антон Загурдаєв

Провідний спеціаліст департаменту мікроскопії та лабораторного обладнання

Спеціалізація: рішення для мікроскопії та гістопатології.