Гіпоксія головного мозку - що це таке і симптоми

Хоча практична важливість вивчення клітинних сигнальних шляхів, що беруть участь у гіпоксичній реакції, чітко усвідомлена і зрозуміла в широкому діапазоні біологічних застосувань, розробка модельних систем для точного вивчення впливу низького рівня кисню на клітини і тканини залишається технічно складною для більшості лабораторій. Один загальний хіміко-біологічний підхід у вивченні дерегулюючих ефектів/наслідків деактивації HIF-1 включає додавання хлориду кобальту (CoCl2) в культуру клітин. CoCl2 може імітувати ефекти гіпоксії шляхом стабілізації HIF-1 комплексу і, таким чином, активації HIF-1-індукованих генів. Проте, CoCl2 вибірково впливає на HIF-1-залежні біохімічні перетворення і сигнальні шляхи і не виробляє модулюючої дії на інші, індуковані станом гіпоксією опосередковано залежні біохімічні і функціональні процеси.

У свою чергу, методики візуалізації процесів гіпоксії включають використання інвазивних електродів кисню для вимірювання рівня кисню в тканині, цільових барвників HIF-1 або GLUT1 для спостереження за непрямими ознаками гіпоксії в клітинах, а також використання нітроімідазолу, який зв’язується з білками і тіолами в гіпоксичній тканині при станах гострого нестачі кисню.

Гіпоксія — це низький вміст кисню в тканинах, що, значною мірою, сприяє виникненню та розвитку патофізіології найпоширеніших захворювань людини, серед яких:

1. ішемія міокарда та ішемія головного мозку;
2. рак;
3. легенева гіпертензія;
4. вроджена вада серця та хронічна обструктивна хвороба легень.

Хоча значення гіпоксії в біологічних процесах добре відоме, створення модельних систем для точного контролю гіпоксичних умов in vitro та in vivo є надзвичайно складним для більшості дослідників, які не мають доступу до інструментарію, що забезпечує точне управління та підтримку температурного режиму, вологості та вмісту газів (СО2 та О2) під час експерименту. На щастя, EVOS ™ FL Auto Imaging System із зовнішнім СО2-інкубатором забезпечує дослідників простою у використанні платформою, яка дозволяє точно контролювати рівень кисню, тим самим дає можливість оцінити клітинну відповідь на гіпоксію шляхом флуоресцентної візуалізації живих клітин з використанням Image-iT™ Hypoxia Reagent (Рис. 1).

Особливо важливими питання гіпоксії виявляються в площині вивчення патологічних пухлинних процесів. Адаптація до станів гіпоксії є життєво важливою для розвитку пухлини та її виживання [[i]]. У проблемі гіпоксії та пухлинного росту має місце певний парадокс: з одного боку, гіпоксія як несприятливий фактор для клітин і тканин повинна стимулювати апоптоз і елімінувати клітини, що гинуть, з іншого — як випливає з численних спостережень, гіпоксія стимулює пухлинну прогресію. Крім того, саме порушення нормального перебігу біохімічних реакцій в умовах гіпоксії може призвести до лейкозних перетворень [[ii]]. Гіпоксичні реакції також мають важливе значення для нормального розвитку кровотворних стовбурових клітин, які постійно знаходяться всередині гіпоксичного мікросередовища кісткового мозку. Сигнальні шляхи, що реалізуються при гіпоксії, є визначальними для подальшої диференціації клітини, що веде до нормального гемопоезу [[iii]]. Адаптація до гіпоксії опосередковується в основному за рахунок активації транскрипції генів, які полегшують короткострокові (наприклад, транспорт глюкози) і довгострокові (наприклад, ангіогенез) адаптаційні механізми. Ключовим регулятором клітинної відповіді в умовах гіпоксії є транскрипційний фактор HIF-1 (гіпоксія індукований фактор-1), який функціонує як головний регулятор клітинної та системної відповіді на гіпоксію через активацію транскрипції широкого спектру генів, у тому числі тих, що беруть участь в енергетичному обміні, ангіогенезі та еритропоезі, а також генів, білкові продукти яких збільшують доставку кисню до цільових клітин або сприяють метаболічній адаптації до гіпоксії.

[i] Giaccia AJ, Simon MC, Johnson R (2004) The biology of hypoxia: the role of oxygen sensing in development, normal function, and disease. Genes Dev 18:2183–2194.

[ii] Gezer D, Vukovic M, Soga T et al. (2014) Concise review: genetic dissection of hypoxia signaling pathways in normal and leukemic stem cells. Stem Cells 32:1390–1397.

[iii] Rankin EB, Giaccia AJ, Schipani E (2011) A central role for hypoxic signaling in

cartilage, bone, and hematopoiesis. Curr Osteoporos Rep 9:46–52.

В останні роки 3D культивування in vitro дозволило здійснити істотний прорив у клітинній біології як такій і вивченні пухлинних процесів зокрема (див. «Мнемосхеми життя в трьох вимірах», стор. 20). Сфероїд багатоклітинної пухлини (MCTS) – 3D структура з діаметром 200-500 мкм, є вкрай корисною моделлю для вивчення біології раку. Вкрай точно імітуючи фізіологію малих аваскулярних пухлин [[i]], сфероїди в цій моделі підтримують хімічні градієнти кисню, поживних речовин і катаболітів в такому ж обсязі, як і пухлина в природних умовах; Крім того, вони також мають гістоморфологічні та функціональні особливості, аналогічні пухлинам.

[i] Kunz-Schughart LA (1999) Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biol Int 23:157–161.

Обидва об’єкти досліджень – сфероїди і пухлини – виявляють неоднорідний розподіл типів клітин, патернів експресії і неоднорідну фізіологію функціонування. Клітини, розташовані на поверхні сфероїда, секретують специфічні сполуки, як якщо б це робила пухлина in vivo. Внутрішньо сфероїди мають те саме гіпоксичне ядро, що й пухлини; це гіпоксичне ядро є однією з найбільш мінливих характеристик 3D культур, які не відтворюються в класичних методах 2D культивування. Таким чином, модель MCTS відтворює з надзвичайною точністю модель солідних пухлин in vivo: клітини швидко переростають кровопостачання, в результаті чого центр пухлини функціонує з надзвичайно низькою концентрацією кисню (малюнок 2).

Рисунок 2. Пухлинні сфероїди візуалізовані з використанням Image-iT Hypoxia Reagent.

(А, В) Клітини HeLa вирощували на 96-лункових планшетах Thermo Scientific ™ Nunclon ™ SPHERA ™ з U-подібним дном протягом 2-х днів для утворення сфероїда. Сфероїди інкубували в присутності 5 мкМ Image-iT Hypoxia Reagent (червоний, кат. No. H10498) протягом 3 год. NucBlue™ Live ReadyProbes™ Reagent (blue, Cat. No. R37605) був використаний в якості ядерного контрастного барвника. Зображення були отримані на ™ FL Auto Imaging System Evos.

(C), клітини HeLa нарощувалися на NanoCulture пластинах (Scivax Life Sciences) протягом 6 днів для утворення сфероїда, а потім сфероїди фарбували 10 мкМ Image-iT Hypoxia Reagent протягом 1 години. Зображення були отримані на конфокальному мікроскопі Цейсс ™ LSM 710. Обмін киснем є важливим фізіологічним процесом, який необхідний для підтримки життєздатності клітин і їх нормального функціонування.

У той час як практична важливість вивчення клітинних сигнальних шляхів, що беруть участь у гіпоксичній реакції, чітко усвідомлена і зрозуміла в широкому діапазоні біологічних застосувань, розробка модельних систем для точного вивчення впливу низького рівня кисню на клітини і тканини залишається технічно складною для більшості лабораторій. Один загальний хіміко-біологічний підхід у вивченні дерегулюючих ефектів/наслідків деактивації HIF-1 включає додавання хлориду кобальту (CoCl2) в культуру клітин. CoCl2 може імітувати ефекти гіпоксії шляхом стабілізації HIF-1 комплексу і, таким чином, активації HIF-1-індукованих генів. Проте, CoCl2 вибірково впливає на HIF-1-залежні біохімічні перетворення і сигнальні шляхи і не виробляє модулюючої дії на інші, індуковані станом гіпоксією опосередковано залежні біохімічні і функціональні процеси.

У свою чергу, методики візуалізації процесів гіпоксії включають використання інвазивних електродів кисню для вимірювання рівня кисню в тканині, цільових барвників HIF-1 або GLUT1 для спостереження за непрямими ознаками гіпоксії в клітинах, а також використання нітроімідазолу, який зв’язується з білками і тіолами в гіпоксичній тканині при станах гострого нестачі кисню.

Візуалізація живих клітин в інкубаторах з точно контрольованими рівнями кисню, зазвичай проводиться в умовах низьких концентрацій кисню, з метою забезпечення довгострокового росту клітин в умовах гіпоксії. Проте, в режимі реального часу візуалізація клітинних процесів у відповідь на гіпоксичні умови стає проблематичною при перенесенні клітин з інкубатора в мікроскоп з метою отримання зображення. Мало того, що важко досягти точного контролю рівня кисню в інкубаторі, але і процеси реоксигенації можуть призводити до отримання помилкових даних в пролонгованих процесах отримання зображень гіпоксичних клітин. EVOS FL Auto Imaging System with Onstage Incubator включає в себе екологічну камеру, що дозволяє точно контролювати рівні кисню, температуру і вологість повітря, тим самим забезпечуючи ефективну систему досліджень і оцінки клітинної відповіді на гіпоксію протягом тривалого періоду часу за допомогою флуоресцентних зображень живих клітин. Концентрації газів контролюються програмним забезпеченням системи EVOS FL Auto, що дозволяє культивувати клітини з використанням точних концентрацій O2 протягом тривалого періоду часу. EVOS FL Auto Imaging System надзвичайно проста у використанні: просто введіть бажаний рівень O2.

З використанням Image-iT Hypoxia Reagent і Evos FL Auto Imaging System, візуалізація живих клітин може виконуватися в умовах гіпоксії в режимі реального часу. Image-iT Hypoxia Reagent – флуорогенний реагент, що проникає в клітину для вимірювання гіпоксії в живих клітинах. Дана сполука не є флуоресцентною в середовищі з нормальним вмістом кисню (приблизно 20%) і стає все більш і більш люмінесцентною при зниженні рівнів кисню. На відміну від нітроімідазолу (наприклад, pimonidazole), який реагує тільки при дуже низьких рівнях кисню (<1%) [[i],[ii]], Image-iT Hypoxia Reagent починає флуоресціювати, коли рівень кисню опускається вже нижче 5%.

[i] . Arteel GE, Thurman RG, Yates JM et al. (1995) Evidence that hypoxia markers

detect oxygen gradients in liver: pimonidazole and retrograde perfusion of rat liver.

Br J Cancer 72:889–895.

[ii] Gross MW, Karbach U, Groebe K et al. (1995) Calibration of misonidazole labeling by simultaneous measurement of oxygen tension and labeling density in multicellular spheroids. Int J Cancer 61:567–573.

Переваги Image-iT Hypoxia Reagent:

• починає флуоресціювати при рівні кисню нижче ~5%;
• швидко реагує на зміни навколишнього середовища;
• простий у використанні: додавання в середовище культивування, візуалізація за допомогою мікроскопа/системи візуалізації.

Реагент, що володіє вищеописаними властивостями, є ідеальним інструментом для виявлення гіпоксичних умов в пухлинних клітинах, 3D культурах, сфероїдах нейронів та інших тканинах, що використовуються як об’єкти візуалізації в дослідженнях гіпоксії. Реагенти з аналогічними властивостями, як показано, вже ефективно використовуються у виявленні пухлин у дрібних тварин, крім того, їх флуоресцентні властивості корелюють із підвищенням експресії HIF-1α та його транслокацією в гіпоксичних умовах [[i]].

[i] Zhang S, Hosaka M, Yoshihara T et al. (2010) Phosphorescent light-emitting iridium com

При постановці експерименту з візуалізації фіксованої клітини, експресія HIF-1 використовується в якості маркера для моніторингу стану життєздатності клітин після впливу гіпоксії. HIF-1α mouse monoclonal antibody забезпечує високоспецифічний зонд для оцінки експресії HIF-1 в зразках фіксованих клітин. Thermo Scientific ™ під брендом Pierce ™ пропонує ряд антитіл, які розпізнають HIF-1 і були верифіковані для роботи різними методиками, в тому числі імуноцитохімією (ICC), імуногістохімією (IHC), Вестерн-блоттом і імунопреципітацією.

EVOS FL Auto Imaging System with Onstage Incubator дозволяє точно контролювати концентрації кисню, долаючи технічні перешкоди, які заважали дослідженням гіпоксії в минулому. Ця easy-to-use система в поєднанні з Image-iT Hypoxia Reagent, ідеально підходить для вивчення ролі клітинних реакцій організму на гіпоксію в нормі і патології. Відвідайте www.thermofisher.com/evosflauto і завантажте покрокову інструкцію для створення гіпоксичних умов з використанням Evos FL Auto Imaging System with Onstage Incubator.