Як побачити біоплівки. Вивчення біоплівок за допомогою конфокального мікроскопа Leica SP E

Автор: Олена Мошинець, к.б.н., с.н.с. відділу регуляторних механізмів клітини, інститут Молекулярної біології і генетики НАН України

Я – мікробіолог, працюю в науковому інституті академії наук. Мій головний предмет дослідження – біоплівки переважно бактерій. Я дуже люблю різні види мікроскопій, але особливо я люблю конфокал! Я доклала дуже багато зусиль, щоб розжитися власним лазерним конфокальним сканувальним мікроскопом, і тепер він залучений майже в усі мої проекти.

Конфокальна лазерна сканувальна мікроскопія, вона ж КЛСМ, це така собі супер-світлова мікроскопія, коли зразок опромінюється світлом, але бачимо ми зразок не в прохідному світлі, як в звичайному мікроскопі, а у відбитому. Для того, щоб зразок відбивав, тобто, генерував власне світло, він забарвлюється різними флуоресцентними барвниками, які починають випромінювати світіння під час їхнього зв’язування з певними молекулами – білками, вуглеводами, ДНК. Таким чином, ми не тільки бачимо об’єкт, але і визначаємо, з чого він складається.

Ще одна важлива перевага КЛСМ в тому, що завдяки когерентності лазерних променів ми можемо робити оптичні зрізи об’єкта по фокальній площині, відсікаючи світіння поза фокусом. На практиці це дає високу деталізацію 3D структури живого ні разу не висушеного, нарізаного або ще якось обробленого / зміненого об’єкта.

Трохи про біоплівки

До 90-х років минулого століття існувала думка, що гриби і бактерії, особливо бактерії, живуть як окремі організми. Але в 90-х одним сміливим німецьким мікробіологом Костертоном було резюмовано уявлення про поведінку бактерій в навколишньому світі, і висунута концепція біоплівок, яка давно вже не концепція, а визнаний факт.

Отже, бактерії не живуть як індивідуалісти-соціопати, вони будують міста, в яких розподіляють функції і протистоять навколишнім негараздам, попутно конкуруючи з іншими жителями в своїй мікроніші. Саме в біоплівках бактерії викликають хронічні інфекції, захищаються від антибіотиків і клітин імунної системи, перебувають в анабіозі, вирощують толерантність до антибіотиків, яка завжди веде до появи генетичної резистентності. Про біоплівки як стратегії взаємодії бактерій з навколишнім світом можна говорити годинами, тому краще подивитися.

Це – біоплівка дріжджового грибка кадіди, Candida albicans, знята на конфокалі. Синім кольором специфічно забарвлена ​​хітинова клітинна стінка гриба, а червоним – клітинна хромосома, ДНК. Біоплівки дріжджів не такі цікаві, різноманітні і складні як бактеріальні.

А це – п’ятиденна біоплівка синьогнійної палички, Pseudomonas aeruginosa. Синій сигнал – потужний полісахаридний матрикс вже зрілої біоплівки – будівельний матеріал, який бактерії виділяють для того, щоб побудувати своє «місто».

Полісахарид зволожує біоплівки, утримуючи вологу, сорбує токсини, не пропускаючи антибіотики. Червоний сигнал відповідає ДНК. Але тут не все просто: в нижньому правому куті явно видно дрібні клітини, це, власне, бактерії, вкриті матриксом біоплівки. Клітини містять багато ДНК, тому фарбуються повністю. А ось рвані червоні «хмари», що вкривають бактерії, – це позаклітинна ДНК – приголомшливий механізм пригнічення імунної відповіді у організму-господаря, клейкий будівельний матеріал і депо генів стійкості до антибіотиків просто в ніші, де живуть бактерії.

Синьогнійка – лідер з використання позаклітинної ДНК, з позаклітинної ДНК складаються її біоплівки в перші 48 годин свого поселення в організмі господаря. Тільки потім підключається синтез полісахаридів (нагадаю, синій сигнал). Зелений сигнал – це наші власні дослідження – специфічне забарвлення амілоїдних фібрил, які теж входять до складу позаклітинної частини біоплівки. Амілоїдні фібрили – суперскручені практично нерозчинні білки у вигляді тонких паличок-фібрил, які теж дуже липкі, вони чудово стабілізують позаклітинну ДНК, не даючи їй «розповзатися» з біоплівки.

На початку минулого року ми з колегами опублікували цей новий унікальний супер-чутливий барвник для візуалізації т.зв. функціональних бактеріальних амілоїдів (патологічні амілоїди – бляшки в мозку хворого синдромом Альцгеймера). Я сподіваюся, що ці роботи на стику фізики, хімії та біології триватимуть далі.