Визуализация микроэлементов с помощью масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой и системой лазерной абляции (МС-ИСП-ЛА). Новые области применения

Металломика представляет собой метод изучения металлобиохимии клеток организма в здоровом и болезненном состоянии. В данном обзоре мы попытались описать применение масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой и системой лазерной абляции (МС-ИСП-ЛА) для визуализации изображений, а также обозначить ее потенциал для получения дополнительных знаний в области биоанализа и металломики.

Качественное и количественное определение микроэлементов является основной задачей масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (МС-ИСП). В большинстве случаев концентрация ряда элементов позволяет использовать данный метод для их выявления в образце (часто он требует предварительной конденсации). Использование в сочетании с МС-ИСП методики лазерной абляции (ЛА) позволяет получить дополнительные данные об изотопе данного элемента в образце, избегая при этом трудоемкого и сопряженного с риском загрязнения процесса конденсации.

МС-ИСП-ЛА также позволяет анализировать небольшие образцы с высоко-локализованными различиями в концентрациях микроэлементов. Более высокие чувствительность и способность устранять помехи с помощью тройных квадрупольных масс-спектрометров, а также ускоренные лазерные системы со специализированными абляционными ячейками, которые обеспечивают быстрое вымывание материала из отдельных лазерных импульсов, проложили путь для новых областей применения МС-ИСП-ЛА.

Программное обеспечение прибора поддерживает рекомбинацию данных, которые были получены в серии линейных сканирований и охватывают всю площадь образца. В сочетании с информацией о положении лазера во времени (в частности, скорости абляции, размере фокального пятна и скорости его движения) оно позволяет воспроизводить полную картину распределения элементов в образце. В особенности это полезно для исследования биологических образцов, для которых роль микроэлементов, участвующих в биологических процессах, неизвестна.

Данная статья объясняется принцип действия МС-ИСП-ЛА для визуализации изображений, а также ее потенциал для получения дополнительных знаний в области биоанализа и металломики. Более конкретно, метод будет использоваться для исследования влияния уровня загрязнения окружающей среды на распределение тяжелых металлов в мозге сторожевых видов животных в зонах с высоким уровнем урбанизации.

Металломика представляет собой комплексный подход для понимания металлобиохимии клеток организма в здоровом и болезненном состоянии, который предполагает использование аналитических инструментов для выявления биологической роли металлов как в пространстве, так и во времени. Структура, катализ и регуляторная функция каждого десятого белка в организме человека зависит от наличия цинка, а для функционирования каждого второго из них требуется присутствие ионов данного металла. При этом, как состав металла, так и его распределение в клетках и тканях изменяются в ходе физиологических и патофизиологических процессов, от которых зависит появление, прогрессирование и лечение различных заболеваний.

В каждой клетке можно найти широкий спектр ионов металлов (таких как натрий, калий, магний, кальций, железо, молибден, марганец, цинк и медь) и неметаллов (таких как хлорид, бромид, йодид и селен) в сочетании с элементарными строительными блоками биологических молекул (такими как углерод, кислород, азот, водород, сера и фосфор). Таким образом, в зависимости от функций и расположения каждый тип клеток имеет уникальный ионный состав или «металло́м». Эти сведения могут использоваться для выявления клеток с различными характеристиками:

  • высоко пролиферативных или злокачественных;
  • стареющих на фоне различных хронических заболеваний (например, слабоумие, диабет и рак);
  • больных;
  • гибнущих по регулируемому или нерегулируемому сценарию.

До развития элементной биовизуализации, которая достигатся с помощью сопряженных инструментов, таких как масс-спектрометр с индуктивно-связанной плазмой и системой лазерной абляции, анализ биологических образцов в основном проводился с помощью методов объемной количественной оценки и видообразования. Однако на данный момент очевидно, что данная информация о составе биологической ткани не позволяет получить ее пространственную визуализацию, которая необходима для глубокого изучения роли биологических металлов на клеточном и субклеточном уровнях.

Таким образом, углубление понимания роли биометаллов в фундаментальной биологии требует дополнительной информации о пространственной локализации металлов в тканях. В значительной степени эта потребность была удовлетворена с помощью ряда методов элементной биовизуализации, включая (но не ограничиваясь) синхротронную рентгеновскую спектроскопию, вторичную ионную масс-спектрометрию (ВИМС) и МС-ИСП-ЛА.

Материалы и методы

Результатом анализа методом МС-ИСП-ЛА, который предоставляет информацию о распределении элементов по двумерной области образца, являются элементарные изображения или карты. Примером может служить поверхность среза биологической ткани.

В ходе анализа лазерный луч достигает поверхности образца, который перемещается с определенной постоянной скоростью. Временной профиль линейного сканирования переводится в профиль расстояния. Сбор нескольких профилей образца генерирует 2D-изображение распределения элементов нем, последовательные 2D-карты изображений образца составляют 3D-карту, в которой интенсивность сигнала прямо пропорциональна концентрации. Чтобы избежать появления «артефактов», рабочий цикл прибора МС-ИСП и скорость перемещения лазера должны быть синхронизированы. На рис. 1 представлен процесс формирования такого изображения.

Рис. 1: Процедура получения изображений с использованием МС-ИСП-ЛА для избежания потенциальных артефактов.

Рис. 1: Процедура получения изображений с использованием МС-ИСП-ЛА для избежания потенциальных артефактов.

Чтобы получить изображение данного образца, необходимо выбрать подходящую область или область с помощью дополнительных методов визуализации, таких как классическая гистология или микроскопия неокрашенных образцов.

Образцы обычно предоставляются для анализа в виде тонких срезов на предметных стеклах микроскопа. В зависимости от типа образца и требуемого уровня структурной сохранности образцы фиксируются в формалине и заключаются в парафиновые блоки (FFPE), либо подвергаются криоконсервации с заливочной средой или без нее. В случае использования заливочной среды с целью избежать высокого фона необходимо выбрать материал с чистотой, которая подходит для конкретных микроэлементов.

Чтобы сбалансировать время анализа и размер полученного изображения, необходимо оптимизировать размер фокального пятна лазера. Этот параметр влияет на пространственное разрешение изображения, чувствительность и скорость анализа. Большой размер пятна уменьшают количество материала и, следовательно, позволяют большему количеству образца достигать плазмы, в то время как формирование изображения достигается за более короткое время. Размеры пятен 10-25 мкм могут обеспечить разумное пространственное разрешение в зависимости от типа ткани и поставленных исследовательских задач. Небольшой размер пятна (ниже 5 мкм) обеспечивают превосходное клеточное разрешение, но требуют высокой чувствительности для получения отношения сигнал/шум (S/N) на уровне 10, который часто считается минимумом для количественного исследования. Субклеточное разрешение (менее 1 мкм) может быть получено с помощью подхода, который называется «избыточной выборкой».

Важен также правильный выбор длины волны лазера и газа-носителя. Сочетание лазерной системы, которая имеет глубокий ультрафиолетовый (УФ) диапазон частот (например, 193 нм) и гелия в качестве газа-носителя часто обеспечивает максимальный результат. Ключевые сравнительные исследования описывают рабочие характеристики лазерных системам с диапазонами 193-213 и 193-266 нм.

Для получения высококачественных изображений с достаточным контрастом для дифференциации подробных структур важно, чтобы система МС-ИСП, которая используемая для анализа, могла обеспечивать высокий уровень соотношения сигнал/шум для исследуемых элементов. Эти параметры включают не только чувствительность обнаружения, но и полное подавление помех. Выявление особенно важных для исследований в области металломики элементов, такие как железо, марганец, медь или цинк, может быть значительно затруднено вследствие полиатомных и других взаимодействий, в частности:

На фоне роста интереса к пониманию метаболизма питательных веществ визуализация дополнительных элементов, таких как Se, P и S, также может быть значительно затруднено вследствие полиатомных интерференций. Полное удаление этих интерференций в сочетании с высокой чувствительностью выявления часто достигается только с помощью приборов МС-ИСП на базе тройных квадруполей. Типичные условия для такого анализа часто аналогичны условиям, приведенным в таблице 1.

Результаты

В наши дни появляется все больше научных свидетельств, которые связывают воздействие загрязнения воздуха с негативным воздействием на мозг – от когнитивных нарушений в детском возрасте до роста случаев деменции среди пожилых людей. Дисгомеостаз металлов был признан причиной ряда нейродегенеративных расстройств. Также предварительные данные связывают эти расстройства с накоплением металлов в мозге собак и людей на территориях с сильным загрязнением.

При этом, остается неясным, как именно экзогенные металлы накапливаются в мозге. В то же время некоторые данные подтверждают поглощение богатых металлами наночастиц обонятельными нейронами в носу, которые переносят их в область обонятельной луковицы мозга. Предполагается, что в дальнейшем эти частицы могут попадать в кровеносную систему, пересекая гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). С учетом любых путей поглощения, исследования могут представить совсем небольшое количество данных о том, как именно связанные с частицами крови металлы движутся через паренхиму мозга и накапливаются ли они в ней. Изучение этих вопросов является сложной задачей, связанной с необходимостью решения долгосрочных накопительных процессов и ограниченным доступом к соответствующему материалу в клинических условиях.

Чтобы выполнить поставленную задачу было предложено исследовать концентрацию и распределение металлов в мозге так называемых сторожевых видов животных, в частности, их популяций с четким контрастом воздействия загрязнителей воздуха, связанных с городским траффиком. В качестве объекта исследования была выбрана восточная серая белка, популяция которой контролируется в Лондоне и по всему Соединенному Королевству. Этот вид предоставляет собой уникальный ресурс для изучения влияния загрязнения окружающей среды на долгосрочное накопление металлов в мозге. 

В данной статье представлены предварительные данные применения МС-ИСП-ЛА для изучения элементарных паттернов в мозге белок, которые обитают во Внутреннем (высокий уровень загрязнения) и Внешнем (низкий уровень загрязнения) Лондоне. После выбраковки целые мозги были извлечены патологоанатомами Лондонского зоологического общества, а позже заморожены. Подверженные заморозке образцы были подвергнуты криосекции и просушены на предметных стеклах толщиной 20 мм, а затем исследованы прибором МС-ИСП-ЛА с разрешением 40 мм для 63Cu, 57Fe и 208Pb, с использованием 31P в качестве морфологического индикатора.

Репрезентативные изображения представлены на рис. 2. Эти данные являются предварительными, но очевиден явный контраст пространственного распределения выбранных элементов между участками с низким и высоким уровнем загрязнения (самые отчетливые на панели С). Данные показывают, что уровень Cu (часто связанного с тормозной пылью) повышен в области обонятельной луковицы животных, которые живут во Внутреннем Лондоне, тогда как Pb оказался повышенным у животных из Внешнего Лондона. Кроме того, концентрация Cu, по-видимому, была выше в мозге белок из Внутреннего Лондона. В целом, Fe оказался выше в образце из Внешнего Лондона, что указывает на высокую концентрацию в средней области мозга и четких очагах высокой интенсивности, рассеянных по всей паренхиме.

Рис. 2: Лазерная абляция МС-ИСП изображений осевого среза репрезентативных мозгов белок из Внутреннего (IL) и Внешнего (OL) Лондона с разрешением 40 мкм.

Рис. 2: Лазерная абляция МС-ИСП изображений осевого среза репрезентативных мозгов белок из Внутреннего (IL) и Внешнего (OL) Лондона с разрешением 40 мкм.

На панели (а) показана концентрация 31Р из OL, которая используется в качестве общего морфологического показателя, с указанием анатомических областей мозга. * указывает на область, которая использовалась для оптимизации метода абляции. На панели (b) показаны концентрации Cu, Fe и Pb. Панель (с) иллюстрирует комбинированное распределение элементов в образцах.

Как отмечалось выше, в настоящее время эти изображения могут считаться лишь свидетельством того, что данная методика может предоставлять полуколичественные пространственные данные о концентрации металлов в головном мозге. Данная работа может быть расширена в случае использования более полного набора образцов и проведения традиционного анализа растворенных образцов методом МС-ИСП.

 В конечном счете, эти методы предполагают, что элементные карты были связаны с классическим патогистологическим исследованием тканей, что позволит скоррелировать интенсивность распределения металлов в образце с маркерами неврологических заболеваний, либо механическими повреждениями, которые позволят связать воздействие загрязнителей воздуха и развитием заболеваний. Для этого требуется применение других многомодельных аналитических методов.

Выводы

МС-ИСП-ЛА позволяет проводить изотопное картирование ряда элементов в биологических образцах с высокой чувствительностью и высоким разрешением. Одним из основных недостатков данного метода является риск разрушения образца, что особенно применительно к биологическим образцам. В отличие от применения в геологии, при котором нанометровые слои могут быть удалены с поверхности твердых материалов, при элементной биовизуализации МС-ИСП-ЛА клетки и ткани полностью удаляются с их опорных субстратов.

Разрешение, которое в настоящее время может быть достигнуто с помощью МС-ИСП-ЛА, особенно при избыточной выборке, открывает новые возможности для субклеточной визуализации, которая по-прежнему в значительной степени зависит от размера клетки и концентрации интересующих элементов в ней. Быстрое развитие лазерного оборудования, которое способно обеспечить меньший размер пятна и, следовательно, картографирование с более высоким разрешением, теперь требует чувствительности для исследования небольших образцов.

В зависимости от типа МС-ИСП (одиночный квадруполь, тройной квадруполь, Time-of-flight-камера) чувствительность может быть ограничивающим фактором для изображения эндогенных металлов с высоким разрешением (например, 1 мкм), особенно при выявлении низких концентраций вещества.

В свою очередь сила этого аналитического метода (особенно применительно к металломике) заключается в его включении в корреляционные полимодельные процессы визуализации и молекулярно-масс-спектрометрии, так что информация, относящаяся к химической среде, связанной с конкретными элементами, характеризуется и может быть помещена в контекст конкретных биологических процессов и лежащих в их основе механизмов.