Определение нитрозаминов в фармацевтической продукции и сырье

Нитрозамины — это молекулы, содержщие нитрозофункциональную группу и являющиеся хорошо известными высоко мутагенными загрязнителями, которые формируются реакцией вторичных аминов с нитритом в кислотных условиях.
Нитрозамины

Негативное влияние нитрозаминов изучалось годами. Известно более 300 их видов, и более чем 90% из них демонстрируют канцерогенность на различных типах животных. Наличие нитрозаминов контролируется в пищевых продуктах, косметических и табачных изделиях, растворителях и алкогольных напитках. Они относятся к 1 классу загрязнителей в соответствии с указаниями ICH M7 (R1). Кроме того, нитрозамины – часть печально известной «cohort of concern«, вместе с афлатоксиноподобными веществами, азокси-соединениями и диоксинами.

Особый риск представляет то, что нитрозамины очень легко формируются в результате взаимодействия вторичных или третичных аминов с анитрозующим агентом, а нитриты или амины могут присутствовать как непреднамеренные загрязняющие вещества в сырье, реагентах и растворителях, используемых при производственных процессах, и могут привести к образованию нитрозаминов в конечных лекарственных продуктах.

Первый случай обнаружения нитрозаминов в лекарственных средствах был зарегистрирован в 2018 году. Препаратом, контаминированным NDMA (N-нитрозодиметиламин) оказался валсартан, который вследствие этого был отозван с рынка. С 2018 до середины 2020 года отозваны еще более 40 партий различных препаратов, в большинстве — группы сартанов. Возникновение NDMA и NDEA в сартанах связывают с тем, что при приготовлении в качестве растворителей использовались амины или растворители, содержащие примеси аминов. Позднее появились данные, что возникновение нитрозаминов может быть следствием загрязнения сырья, реагентов и растворителей.

Лидером 2020 года по количеству отзывов стал метформин, а открытием — примеси новых нитрозаминов MNP и CPNP в рифампицине и рифапентине. В этот раз препараты отозваны не были, поскольку риск для здоровья пациентов, связанный с их отзывом, превышал потенциальную опасность от загрязнителей.

Результатом мониторинга количества нитрозаминов в лекарственных препаратах стало регулирование их содержания и установление временного значения суточной дозы для отдельных примесей, приведенных в таблице 1.

Таблица 1 Временные значения суточной дозы отдельных примесей

Сокращение Химическое название Суточная доза
NDMA N-нитрозодиметиламин 96,0 мкг/ сутки
NDEA N-нитрозодиэтиламин 26,5 мкг/ сутки
NMBA N-нитрозо-N-метил-4-аминобутановая кислота 96,0 мкг/ сутки
NDIPA N-нитрозодиизопропиламин 26,5 мкг/сутки
NMPA N-нитрозометилфениламин 26,5 мкг/сутки
NEIPA N-нитрозоэтилизопропиламин 26,5 мкг/сутки
NDBA N-нитрозодибутиламин 26,5 мкг/сутки

Для расчета допустимой суточной дозы примесей нитрозаминов, не указанных в таблице, рекомендуется следовать принципам, изложенным в руководстве ICH’s M7 (R1).

Эти лимиты применяются лишь тогда, когда лекарственное средство содержит только один нитрозамин. Если более чем одна примесь из таблицы детектируется, и общее количество примесей превышает 26,5 нг/сутки, то необходимо известить об этом регуляторные органы.

Допустимые границы потребления для новых нитрозаминов составили 0,16 частей на миллион (ppm) для MNP в рифампинине и 0,1 ppm для CPNP в рифапентине.

Почему указаны значения временные?

Потому что, согласно со стратегией Европейской Фармакопеи, эти лимиты будут действовать только в течение переходного периода в 2 года (до 1 апреля 2021), который предоставлен для изменения производственных процессов с целью снижения содержания нитрозаминов. Препараты, содержащие концентрации выше указанных, не могут находиться в обороте.

После завершения переходного периода нитрозамины должны отсутствовать в фармацевтических препаратах. Уровни NDMA или NDEA в активных субстанциях должны «не поддаваться количественному измерению» после 1 апреля 2021 года.

Фактически, конечная концентрация нитрозаминов, которая допускается до апреля 2021, высчитывается из максимальной суточной дозы препарата и значения допустимой суточной дозы примеси. Вот, например, для максимальной суточной дозы 1200 мг и допустимой суточной дозы в 26,5 мкг LOQ метода определения должен составлять не более 0,02 мг/кг, или 20 ppb. Аналогичные расчеты для NDMA в метформине с суточной дозой 3000 мг и 96 мкг NDMA дают цифру в 30 ppb.

Если суточная доза продукта составляет менее 880 мг/день, то лимит для суммарного содержания нитрозаминов не должен превышать 0,03 ppm.

Согласно отраслевого руководства FDA, производители АФИ и готовых продуктов должны использовать только методы с LOQ ≤ 0,03 ppm, но при этом надо учитывать, что, например, для того же метформина после разведения препарата в растворителе и подготовки образца конечная концентрация NDMA в виале не должна превышать 1,6 ppb, что делает требования к чувствительности методики определения в готовых продуктах значительно жестче, чем это может показаться на первый взгляд. С другой стороны, соответствующие расчеты для сырья и растворителей наоборот — показывают меньшие требования к чувствительности определения.

Были опубликованы рекомендации всем владельцам лицензий на продажу лекарственных препаратов, которые коротко можно изложить следующим образом:

Компаниям рекомендуется провести следующие шаги:

  • Оценить возможность присутствия нитрозаминов в продукции в течение 6 месяцев.
  • Приоритизировать оценки, начиная с лекарственных средств, которые, вероятно, имеют риск содержания нитрозаминов.
  • Принять к сведению результаты осмотра CHMP по сартанам.
  • Сообщить регуляторным органам о результатах оценки риска.
  • Тестировать продукты с риском содержания любых нитрозаминов.
  • Немедленно сообщать об обнаружении нитрозаминов.

С 1го октября 2020 все операторы фармацевтического рынка должны систематически включать оценку рисков в отношении потенциального возникновения нитрозаминов.

Также 1 сентября 2020 года FDA опубликовала отраслевое руководство по контролю содержания примесей нитрозаминов в лекарственных препаратах для людей, в котором рассматриваются основные причины возникновения нитрозаминовых примесей и даются рекоммендации всем производителям лекарственных препаратов.

Начиная с 2018 года многие международные организации работали над надежными и чувствительными методами определения нитрозаминов в фармацевтической продукции. Сейчас Европейский директорат по качеству лекарственных средств и охране здоровья опубликовал ряд методов, размещенных на их сайте и разработанных Официальными лабораториями контроля лекарственных средств (OMCL) Общеевропейской сети OMCL (GEON).

Итогово они приведены в таблице 2.

Таблица 2: Методики контроля, опубликованные сетью официальных лабораторий контроля лекарственных средств (OMCL).

Название Метод Какие нитрозамины В каких препаратах LOQ
LGL method LC-MS/MS NMBA losartan 28,6 ppb
LGL method Headspace GC-MS NDMA  и  NDEA valsartan, irbesartan, losartan, candesartan, olmesartan 100 ppb NDMA

80 ppb  NDEA

LGL method LC-MS/MS NDMA и NDEA irbesartan, valsartan, and losartan 79-492 ppb NDMA

19,5-149 ppb  NDEA

Swissmedic  GC-MS/MS NDMA, NDEA, EIPNA, DIPNA, DPNA, DBNA valsartan, losartan, irbesartan, olmesartan and candesartan 15 ppb
CVUA Karlsruhe UHPLC-APCI-MS/MS NDMA и NDEA  sartan drug substances and drug products 100-200 ppb NDMA

40-80 ppb  NDEA

CVUA Karlsruhe UHPLC-APCI-MS/MS NDMA valsartan 200 ppb NDMA
 PALG method Headspace GC-MS NDMA tablets of the sartan group Not stated
ANSM method  HPLC-UV NDMA и NDEA valsartan, losartan, irbesartan, candesartan and olmesartan 40-250 ppb NDMA

80-500 ppb NDEA

ANSM method  HPLC-UV NDMA valsartan 300 ppb

Как можно отметить, большинство методов уже не соответствуют требованиям по чувствительности методов, указанных в регуляторных требованиях.

FDA в свою очередь опубликовала ряд рекомендованных методик для определения нитрозаминов в фармацевтических препаратах, приведенных в таблице 3.

Таблица 3: Методики контроля нитрозаминов, опубликованные FDA.

FDA метод Название метода Метод Компоненты LOQ
117843 Combined headspace method GC-MS NDMA, NDEA NDMA – 100 ppb

NDEA – 50 ppb

117807 Combined direct injection method GC-MS/MS NDMA, NDEA NDMA – 50-80 ppb

NDEA – 30-40 ppb

123409 Combined direct injection method GC-MS/MS NDMA, NDEA, NDIPA, NEIPA, NDBA 1-40 ppb  (5-13 для NDMA і NDEA)
124025 Headspace GC-MS/MS method GC-MS/MS NDMA, NDEA, NDIPA, NEIPA 50 ppb
125478 LC-HRMS method LC-HRMS NDMA, NDEA, NEIPA, NDIPA, NDBA, NMBA 50 ppb
142092 LC-ESI-HRMS LC-HRMS MNP, CPNP 17 ppb
125477 Rapid Fire-MS/MS method LC-MS/MS NDMA, NDEA, NEIPA, NDIPA, NDBA, NMBA 100-5000 ppb (тільки для API)
134914 LC-HRMS method LC-HRMS NDMA 30 ppb
138617 LC-ESI-HRMS method LC-HRMS NDMA NDEA NEIPA NDIPA NDPA NMPA NDBA NMBA 5-20 ppb
130801 LC-HRMS method LC-HRMS NDMA 33 ppb
131868 LC-MS/MS method LC-MS/MS NDMA 33 ppb

Их чувствительность уже лучше, но чем ранее опубликованный метод, тем меньшее количество нитрозаминов включены в него. Наиболее чувствительным методом, который позволяет анализировать большое количество нитрозаминов (8 шт) является метод 138617, использующий масс-спектрометрию высокого разрешения, прибор типа орбитальная ионная ловушка (Orbitrap).

А что говорит европейская фармакопея?

Публикуется новая общая статья об анализе нитрозаминов — Аnalysis of N-nitrosamine impurities in active substances (2.4.36).

Основные примеси, которые контролируются в соответствии с ней (7 штук) — N-нитрозо-диметиламин (NDMA), N-нитрозо-диэтиламин (NDEA), N-нитрозо-дибутиламин (NDBA), N-нитрозо-N-метил-4 аминомасляная кислота (NMBA) N-нитрозо-диизопропиламин (NDiPA), N-нитрозо-этил-изопропиламин (NEiPA) и N-нитрозо-дипропиламин (NDPA). Чувствительность анализа согласно статье- ниже 30 ppb. Используются методы ГХ/МС, ГХ/МС/МС и ВЭЖХ/МС/МС, причем ни один из них не используется для определения всех видов нитрозаминов. Наибольшее количество компонентов по этой статье определяет метод ГХ/МС/МС — 6, за ним идет ВЭЖХ/МС/МС, который применяется соответственно для 5 видов примесей. Метод ГХ/МС используется только для анализа NDMA и NDEA.

Компания Thermo Scientific единственная, кто предлагает полный перечень оборудования в соответствии с рекомендованными методами определения нитрозаминов.

Метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ/МС)

Thermo Scientific TriPlus 500 HS

Самым простым методом определения двух основных нитрозаминов NDMA и NDEA является ГХ/МС с парофазным инжектированием. Оба указанных нитрозамина являются летучими соединениями, хорошо переходящими в паровую фазу. При этом подготовка пробы, которая требуется для такого вида анализа — самая минимальная из возможных.

Предел количественного определения метода, разработанного с использованием парофазного пробоотборника Thermo Scientific TriPlus 500 HS, газового хроматографа Trace 1310 и одноквадрупольного масс-детектора ISQ ™ 7000 составляет 15 ppb для NDMA (LOD — 4 ppb) и 30 ppb для NDEA (LOD 9 ppb), что намного лучше, чем предел количественного определения европейских методик и методик FDA, разработанных на аналогичном оборудовании других производителей. При этом такое решение наиболее доступно по цене, а парофазный автосамплер TriPlus 500 HS легко расширяется с базовой конфигурации на 12 виал до решения с максимально-доступной пропускной способностью на 240 образцов.

В силу особенностей конструктивного исполнения система также обеспечивает прямое инжектирование в колонку из парофазного самплера с высокой прецизионностью и точностью, а запатентованная система VPI и NeverVent обеспечивает отсутствие необходимости продувки системы и минимальное время обслуживания прибора (на 98% меньше чем требуется для аналогичных приборов любых других производителей).

Если перед вами стоит задача определения только двух указанных основных нитрозаминов — решение на базе ГХ/МС ISQ ™ 7000 будет идеальным по соотношению цена — качество, и обеспечит чувствительность на уровне последних регуляторных требований.

Метод газовой хроматографии-и тандемной масс-спектрометрии (ГХ/МС/МС)

масс-детектор TSQ ™ 9000

Рассматривая методы с использованием тандемной масс-спектрометрии, мы имеем 2 возможности — парофазное инжектирование для наиболее летучих нитрозаминов, и прямое жидкостное инжектирования с предварительной подготовкой пробы для более широкого перечня компонентов в одном анализе.

Парофазное инжектирование устраняет сложность матрицы, что приводит к снижению фонового шума и улучшению селективности. При этом подготовка пробы остается минимальной. Компанией Thermo Scientific опубликован метод определения 4 нитрозаминов (NDMA, NDEA, NDIPA, NEIPA) с помощью масс-детектора TSQ ™ 9000 с парофазным пробоотборником TriPlus 500 HS аналогичный методу 124025 от FDA, но с лимитом количественного определения от 2 до 10 ppb и лимитом детектирования 2 ppb, что от 5 до 20 раз чувствительнее метода FDA разработанного на аналогичном оборудовании других производителей. Использование запатентованных технологий VPI и NeverVent также обеспечивает минимальное время, необходимое на замену колонки или обслуживание источника, что в сочетании с непревзойденной емкостью парофазного автосамплера TriPlus 500 HS позволяет получить наибольшую доступную пропускную способность прибора.

Переходя к методам с прямым жидкостным инжектированием, мы сталкиваемся с большим влиянием компонентов матрицы, которое делает методику сложнее и требует тщательной подготовки пробы. Метод, опубликованный компанией Thermo на масс-детекторе TSQ ™ 9000 с жидкостным инжектирования для 5 нитрозаминов, дает лимит количественного определения от 0,5 до 1 ppb и лимит детектирования от 0,2 до 0,5 ppb, что значительно превышает требования к максимальному содержанию нитрозаминов и лимитам количественного определения метода.

Средствами улучшения чувствительности и расширения перечня нитрозаминов, которые определяются методом ГХ/МС/МС является:

1) Использование твердофазного экстрагирования (ТФЕ).

2) Использование SPME (твердофазного микроэкстрагирования).

3) Использование дисперсивного твердофазного экстрагирования (dТФЕ).

4) Более мягкая ионизация (для ионизации электронным ударом (ЭИ) и небольших молекул возможна фрагментация до небольших ионов, определению которых может мешать фоновый шум).

При этом использование SPME (твердофазного микроэкстрагирования) легко автоматизируется с помощью автоматического роботизированного самплера TriPlus RSH, что уменьшает влияние человеческого фактора на качество подготовки образцов, увеличивает чувствительность и обеспечивает непревзойденную воспроизводимость анализа.

Метод жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием

масс-спектрометр

Когда мы используем жидкостную хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием для количественного определения минимальных количеств контаминантов — тщательная подготовка проб неизбежна. На масс-спектрометрических детекторах производства компании Thermo разработан метод, включающий только 4 этапа подготовки пробы — измельчение таблетки, экстрагирование встряхиванием в водном растворе, центрифугирование и фильтрование образца. LOQ метода определения NDMA (летучего и сложного для определения жидкостной хроматографией компонента) на самом простом из современной линейки тандемных квадрупольных масс-детекторов Thermo составляет 0,3 мкг/кг. Пользователями Thermo из Индии и Кореи опубликованы методики на определение 6 и 11 нитрозаминов в одном анализе. При этом чувствительность методик составила от 0,25 до 1 ppb абсолютной концентрации, что опять же значительно превышает данные опубликованных методов, разработанных на аналогичном оборудовании других производителей.

Следует отметить, что рекомендованный метод ионизации для обеспечения удовлетворительного чувствительности определения наиболее летучего компонента — NDMA — химическая ионизация при атмосферном давлении. Разница в чувствительности между стандартной ионизацией електроспреем (ESI) и использованием APCI в среднем в 3 раза. Для других компонентов тип ионизации не является принципиальным.

ВЭЖХ/МС/МС метод анализа является обязательным, если одним из компонентов, которые необходимо определять, является NMBA. Учитывая физико-химические свойства указанного нитрозамина, определять его газовой хроматографией не рекомендуется. Для всех остальных нитрозаминов, которые контролируются в соответствии с новой фармакопейной статьей, можно использовать ГХ/МС/МС методику.

Метод жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения прибором типа орбитальная ионная ловушка

Orbitrap Exploris 120

Почему FDA разработало 5 методов с использованием детектора Orbitrap, несмотря на удовлетворительные результаты с использованием тандемного масс-детектирования?

Чаще всего, источником нитрозаминов являются АФИ. Каждый препарат имеет свои свойства, влияющие на эффективность подготовки пробы. Кроме того, готовые лекарственные препараты являются достаточно сложной матрицей, содержащей большое количество компонентов, мешающих анализу. Иногда нитрозамины выходят почти одновременно с пиком АФИ, иногда мешающие пики интерференций искажают количественные результаты по нитрозаминам. Использование масс-спектрометрии высокого разрешения позволяет эффективно разделять нитрозамины от АФИ или интерференций даже для наиболее сложных образцов. В то время как уникальный дизайн орбитальной ловушки обеспечивает чувствительность не хуже, чем у тандемных квадрупольных детекторов, что делает Orbitrap идеальным выбором для типов анализа, требующим одновременно и сверхэффективного разделения и чувствительности на уровне нанограммов.

Метод, опубликованный на модели Orbitrap Exploris 120, которая была анонсирована в 2020 году, обеспечивает эффективное разделение 7 нитрозаминов в концентрации 0,1 нг/мл с RSD по 3 инжекциям от 0 3,36%. Для сравнения предыдущая модель Q-Exactive обеспечивала чувствительность на уровне 0,5 нг/мл с RSD по 10 инжекциям между 0,76 и 1,62%.

Использование масс-детекторов высокого разрешения типа Orbitrap является идеальным выбором для мультикомпонентного анализа с высокой чувствительностью для сложных матриц. В соответствии с методиками FDA этим методом можно контролировать все 7 нитрозаминов, контролируемых в соответствии с текущими регуляторными требованиями. Это единственный метод, опубликованный для определения 6 нитрозаминов в лекарственных препаратах в целом, без привязки к конкретному типу лекарственного средства. Что же касается последних добавленных к контролю нитрозаминов MNP и CPNP — пока опубликован метод только с детектированием детектором типа Orbitrap.

Программное обеспечение для сбора данных и обработки результатов

сбор данных и обработки результатов

Каждая фармацевтическая лаборатория, которая задумывается об использовании методов сложнее, чем одноквадрупольное масс-детектирование, сталкивается с тем, что у каждого производителя для трьохквадрупольного детектирования разработано отдельное программное обеспечение, которое прекрасно справляется со сложными алгоритмами обработки данных и создания масс-спектрометрических методик, но к сожалению не соответствует нормативным требованиям к программному обеспечению в полной мере. Более того — полноценное подключение таких детекторов, управление ими, хранение методик и обработка результатов в сетевых системах, обеспечивающих целостность данных в фармацевтических лабораториях, на данный момент невозможно.

Компания Thermo Fisher Scientific — единственная компания, которая смогла разработать программное обеспечение, в полной мере соответствующее всем нормативным требованиям и одновременно в состоянии управлять сложными масс-спектрометрическим детекторами. Оно одинаково эффективно и безопасно управляет и хранит данные обычных хроматографов и тандемных масс-детекторов.

Программное обеспечение Chromeleon CDS — больше никаких компромиссов!

Программное обеспечение Chromeleon CDS

Безопасное хранение данных, сохранение всех версий результатов, отслеживание и удобный просмотр всех изменений, полная интеграция в сетевую систему Chromeleon CDS. Разделение ролей и доступа пользователей, автоматическое и полное ведение аудиторского журнала — все это вы получаете в одном программном пакете даже с тандемными масс-спектрометрическим детекторами, без необходимости усвоения новых программ и интерфейсов.