Визуализация апоптоза в контексте: мультиплексные наборы Click-iT Plus TUNEL Assays для детекции апоптоза in situ

Поздние стадии апоптоза характеризуются изменениями в ядерной морфологии, конденсацией хроматина, деградацией ядерной оболочки, и в конечном счете фрагментацией клеточной ДНК. В то время как ДНК-связывающие красители (например, Hoechst 33342 ™ и DAPI), как правило, используются для контроля морфологии ядра и конденсации хроматина, фрагментация ДНК обычно детектируется in situ путем пришивки специального меченного нуклеотида на 3‘ конец ДНК – маркировка TUNEL. В данной заметке мы опишем ограничения обычных TUNEL анализов и представим преимущества Click-It ™ Plus TUNEL анализ обнаружения апоптоза in situ. Технология Click-iT Plus позволяет выполнять специфические и чувствительные TUNEL анализы, которые могут быть мультиплексированы с другими функциональными анализами на основе флуоресценции, в том числе теми, которые включают работу с флюоресцентными белками.

С момента своего появления в 1992 году, анализ TUNEL широко используется для обнаружения апоптоза in situ. Анализ TUNEL основан на включении модифицированных аналогов тимидина терминальным ферментом дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT) в 3 / -ОН конец фрагментированной ДНК. Модификация нуклеотида может быть простой — как атомом брома, (5-bromo-2/-deoxyuridine triphosphate или BrdUTP) так и более сложной молекулой, такой как флуорофор или гаптен (например, биотин- dUTP). Инкорпорированый BrdU, как правило, обнаруживается анти-BrdU антителами, а затем визуализируется с помощью вторичного детектирующего реагента. Флуоресцентно модифицированный нуклеотид (например, флуоресцеин – dUTP) может быть обнаружен непосредственно, в то время как биотин обнаруживается косвенным образом путем добавления флуоресцентного коньюгата стрептавидина.

Требуемая обширная фиксация и пермеабилизации клеток необходимая для обеспечения доступа антител к инкорпорированной BrdU может модифицировать важные физические и антигенные характеристики исследуемых клеток и тканей. Неспецифическое фоновое свечение, связанное с использованием систем химической визуализациия «биотин-стрептавидин» делает флуоресцентную детекцию апоптоза на основе TUNEL пробы предпочтительнее. Тем не менее, размер флуорофоров, используемых для модификации нуклеотида может привести к снижению количества и качества инкорпорации, уменьшая чувствительность анализа TUNEL. Кроме того, флуорофоры, используемые в большинстве имеющихся в настоящее время наборов для анализов TUNEL обладают высоким уровнем фотообесцвечивания и дальнейшим снижением чувствительности анализа, часто демонстрируют существенную спектральную способность пересекаться с другими флуоресцентными красителями и белками, ограничивая возможность мультиплексирования с иными зондами на флуоресцентной основе.

And now…Click-iT Plus TUNEL Assays

Наборы Click-iT Plus TUNEL Assays были разработаны специально для in situ анализа апоптоза и устранения причин влияющих на чувствительность, фотообесцвечивание и мультиплексность проведения анализа. В наборах используются EdUTP (dUTP нуклеотид, модифицированный небольшим алкиновым остатком), который включается в 3-х / -ОН конец фрагментированной ДНК с помощью фермента TdT. Детекция основана на высокоспецифичной, катализированной медью, ковалентной реакции между флуоресцентным красителем Alexa Fluor ™ (пиколил азид) и алкиновым фрагментом EdUTP. Из-за небольшого размера алкинового фрагмента, нуклеотид EdUTP гораздо более свободно встраивается TdT по сравнению с другими модифицированными нуклеотидами. Кроме того, небольшой размер пиколилхлорид азида Alexa Fluor обеспечивает легкий доступ к инкорпорированным нуклеотидам, что устраняет необходимость проведения усиленной денатурации ДНК, необходимой для выявления нуклеотидов меченных антителами. Более того Alexa Fluor обладает сильными люминесцентными и фотостабильными свойствами и доступен в трех цветовых вариантах эмиссии для обеспечения мультиплексности проводимой детекции.

Click-iT Plus технология улучшает наборы первого поколения Click-It TUNEL Assays использованием пиколилхлорид азида в сочетании с протектором от воздействия меди – для уменьшения ее воздействия (разрушающего воздействия свободной меди) на сигнал флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или красный флуоресцентный белок (RFP). Кроме того, использования базовых реагентов для фиксации (на основе альдегида) и детергентов для пермеабилизации будет более чем достаточно для обеспечения доступа реагента Click-Plus Edu IT к ДНК; нет потребности использовать сильные денатурирующие агенты. Щадящие условия проведения самой реакции и этапа детекции с использованием Click-iT Plus позволяют мультиплексировать анализ апоптоза с помощью флуоресцентных белков, меченных фалоидинов и других чувствительных к меди флуорофоров (рисунок 1).

Рис 1.  Детекция разрывов ДНК с помощью Click-iT Plus TUNEL Assay.

HeLa клетки обрабатывали DNase I для моделирования разрывов цепочки ДНК. После обработки клеток Click-iT™ Plus TUNEL Assay содержащем краситель Alexa Fluor™ 647 (Cat. No. C10619) и актина красителем ActinGreen™ 488 ReadyProbes™ Reagent (Cat. No. R37110) – становится очевидным красное свечение митохондрий, зеленое свечение актина и фиолетовый сигнал TUNEL локализованный в ядре.

Специфичные, мультиплексные наборы TUNEL

Чтобы продемонстрировать специфичность наборов Click-It Plus TUNEL в различных типах клеток, были получены четыре фиксированных формалином и заключенных в парафин (FFPE) среза тканей. Ткани толстой кишки, сердца, печени и ткани кишечника мыши депарафинизировали, фиксировали и пермиабилизировали. В качестве модели для воспроизведения деструктивных процессов в ДНК, свойственных поздним стадиям апоптоза, срезы тканей были обработаны ДНКазой I. Тканевые срезы, не обработанные ДНКазой I, использовались как контрольные препараты. После обработки, воспроизводящей модель деструкции ДНКи, апоптический сигнал детектировался с помощью Click-It Plus TUNEL анализа на базе красителя Alexa Fluor 594; отсутствие видимой/детектируемой флуоресценции показано на контрольных образцах (рисунок 2).

Рис 2. Click-It Plus TUNEL анализ обнаруживает фрагментацию ДНК в срезах ткани мышей. (А) срезы ткани обработанные ДНКазой I (В) контрольные срезы, без ДНКазы I. Использовался набор Click-It ™ Plus TUNEL с Alexa Fluor 594 ™ (Cat. No. C10618).

Для демонстрации способности мультиплексировать с использованием наборов Click-It Plus TUNEL Assays, были выделены участки ткани кишечника трансгенной мыши, в которых экспрессирующий GFP был локализован в muscularis externa (мышечном слое, окружающем кишечник). Далее срезы ткани были подвергнуты депарафинизации, пермеабилизации и обработаны ДНКазой I. После обработки набором Click-iT Plus TUNEL Assay (краситель Alexa Fluor 594), срезы ткани окрашивали Alexa Fluor 647 и Hoechst 33342. Рисунок 3 ясно показывает, что все четыре флуоресцентные сигнала: фрагментированной ДНК меченной Alexa Fluor 594, muscularis externa экспрессирующей GFP, ядра, меченного Hoechst 33342 и актина окрашенного Alexa Fluor 647 – можно визуализировать в срезе одной ткани.

Рис 3. Мультиплексирование Click-iT Plus TUNEL Assay.

После обработки ДНКазой I ткани окрашивались Click-iT™ Plus TUNEL Assay Alexa Fluor™ 594 dye (Cat. No.C10618), красителем Hoechst™ 33342 (Cat. No. H3570) и Alexa Fluor 647 (Cat. No. A22287). (A) Клеточное ядро окрашенное Hoechst 33342 (синий), (B) сигнал GFP (зеленый) (C) актин окрашенный Alexa Fluor 647 (фиолетовый) (D) TUNEL-positive сигнал в следствии воздействия ДНКазы I отлично визуализируется с помощью набора Click-iT Plus TUNEL Assay с Alexa Fluor 594 (красный). (E) мультиплексное изображение полученное наложением всех сигналов флуоресценции.

Выберите один из трех флуоресцентных цветов

Наборы Click-iT Plus TUNEL Assays для детекции апоптоза in situ доступны в вариациях детектирующего флуоресцентного красителя:

• зеленая флуоресценция (Alexa Fluor 488),
• красная флуоресценция (Alexa Fluor 594)
• темно-красная флуоресценция (Alexa Fluor 647).

Аналиты оптимизированы и содержат все компоненты, необходимые для маркировки и обнаружения апоптотических клеток в срезах тканей или в слое фиксированных клеток, выращенных на покровных стеклах. Комплекты включают в себя достаточное количество реагентов для маркировки 50 покровных стекол (18 х 18 мм) и могут быть сконфигурированы для 50 детекций методом TUNEL. Чтобы узнать больше, перейдите по ссылке.