Жидкостная хроматография и масс-спектрометрия

Жидкостная хроматография – это метод разделения различных химических соединений, который предполагает растворение ионов или молекул образца. Жидкостная хроматография (ЖХ) осуществляется в колонне, на бумаге, либо в тонком слое сорбента. В первом случае образец проходит черед колонну с неподвижной фазой, состоящей из частиц неправильной или сферической формы.

Из-за различий в ионообмене, адсорбции и размере различные растворенные вещества взаимодействуют со стационарной фазой по-разному. По этой причине время прохождения веществ через колонну и общее время исследования может существенно различаться. Колонная газо-жидкостная хроматография предполагает, что при прохождении жидкой подвижной фазы через колонну исследуемые вещества взаимодействуют с неподвижной (стационарной) фазой. Эти взаимодействия основаны на различии показателей:

  • адсорбируемости компонентов смеси в конкретном адсорбенте (жидкостно-адсорбционная хроматография);

  • растворимости сорбатов различных фазах (распределительная хроматография);

  • ионообменного равновесия (ионообменная хроматография);
    растворимости осадков в подвижной фазе (осадочная хроматография);

  • проницаемости молекул разделяемых веществ в неподвижную фазу (эксклюзионная хроматография).


Кроме того, данные взаимодействия могут основываться на биоспецифическом взаимодействии компонентов с аффинным лигандом (аффинная хроматография). Во время процесса разделения взаимодействие между подвижной фазой и исследуемыми соединениями изменяется. Они распределяются между стационарной и подвижной фазами. Затем каждое соединение элюируется из колонки в определенном порядке в зависимости от относительной силы его взаимодействия.

Подвижная фаза (элюат) продолжает течь через колонну, и затем собирается во фракции с разной концентрацией, которые формируют хроматограмму. Режим обнаружения изменяется в зависимости от обнаруживаемого аналита. При применении колоночной жидкостной хроматографии для разделения белков концентрация белка контролируется вручную с помощью красителя. Однако такой ручной контроль является достаточно трудоемким.

Высокоэффективная жидкостная хроматография


Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) представляет собой один из видов колоночной хроматографии, при которой пробная смесь (аналит) в растворителе (подвижная фаза) закачивается в колонну с хроматографическим материалом (стационарная фаза) под высоким давлением. Образец при этом переносится движущимся потоком газа-носителя, в роли которого выступает гелий или азот.

ВЭЖХ – это надежный способ разделять и идентифицировать соединения, присутствующие в любом образце, который может быть растворен в жидкости в концентрациях до 1/1012. Благодаря такой универсальности метод ВЭЖХ широко применяется в науке и промышленности, в частности в фармацевтике, экологии, криминалистике и химической промышленности. В частности, нередко можно встретить использование ВЭЖХ в фармацевтическом анализе.

Основная цель применения ВЭЖХ-метода – идентификация, количественное определение и очистка конкретного аналита или соединения. ВЭЖХ-системы позволяют проводить как количественный, так и качественный анализ. ВЭЖХ можно использовать в следующих областях:

  • очистка воды;

  • идентификация примесей в фармацевтической промышленности;

  • предварительная концентрация микроэлементов;
    лигандообменная хроматография;

  • ионообменная хроматография белков;

  • анионообменная хроматография углеводов и олигосахаридов с высоким уровнем рН.


Время удержания образца в колонне варьируется в зависимости от силы взаимодействия между неподвижной фазой, анализируемыми молекулами, а также растворителем или набором растворителей. В момент прохода через колонну образец взаимодействует между двумя фазами с разной скоростью, главным образом из-за различной полярности анализируемых веществ. Вещества, которые минимально взаимодействуют со стационарной фазой и максимально с подвижной, будут покидать колонну быстрее.

Преимущества


Среди основных преимуществ систем высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ отмечают следующие:

  • управление и автоматизация приборов для хроматографии, в частности, управление данными, функциями безопасности, а также отчетностью и обслуживанием приборов;

  • мощность и быстрая адаптируемость к разным задачам;

  • повышенная производительность за счет управления всеми областями анализа.


Приборы


Основные компоненты системы ВЭЖХ включают один или несколько резервуаров для растворителя, насос высокого давления, саму колонну, инжекторную систему и детектор. Резервуар содержит растворитель (подвижная фаза). Обычно в системе имеется как минимум два резервуара, каждый из которых вмещает до 1000 см2 растворителя и снабжен газовым диффузором, который позволяет барботировать гелий. Насос используется для создания потока подвижной фазы. Хотя ручная инъекция образцов остается доступной опцией, большинство ВЭЖХ-систем в настоящее время полностью автоматизированы и управляются с помощью компьютера.

Инжектор (автоматический пробоотборник) вводит растворитель в фазовый поток, который переносит пробу в колонну высокого давления (до 400 бар), со специальным материалом, необходимым для осуществления разделения (стационарная фаза). Детектор используется для идентификации полос разделенного вещества в момент элюации. Информация передается с детектора на компьютер, который генерирует хроматограмму.

Подвижная фаза выходит из детектора и либо отправляется в отходы, либо собирается по желанию. Эффективным методом дегазации подвижной фазы является распыление гелия. В испарительном детекторе рассеяния света (ELSD) в качестве распыляющего газа также используется азот.