Хроматографический анализ

Хроматографический метод – это важный биофизический метод исследования, который позволяет разделять, идентифицировать и очищать компоненты смеси для качественного и количественного анализа.

Хроматография предполагает отделение молекул смеси, нанесенной на поверхность или в твердое тело, в ходе движения в жидкой неподвижной (стационарной фазе). На интенсивность процесса разделения влияют молекулярные характеристики, связанные с адсорбцией (жидкость-твердое тело), разделением (жидкость-твердое тело) и сродством или различиями между их молекулярными массами. Из-за этих различий некоторые компоненты смеси дольше остаются в неподвижной фазе и медленно перемещаются в хроматографической системе, в то время как другие быстро переходят в подвижную и быстрее ее покидают. Основы хроматографии составляют три компонента:
стационарная фаза, слой жидкости, адсорбированной на поверхности твердой опоры;
подвижная фаза, жидкий или газообразный компонент;
отдельные молекулы исследуемого вещества.

Хроматографический анализ проявил себя как эффективный метод разделения и идентификации малых молекул, таких как аминокислоты, углеводы и жирные кислоты. Хроматографическая классификация включает, в частности, аффинную (ионообменную) хроматографию, которая более эффективна при разделении макромолекул (нуклеиновые кислоты и белки). Плоскостная (планарная, бумажная и тонкослойная) хроматография используется для разделения белков и в исследованиях, связанных с их синтезом. Газожидкостная хроматография используется для разделения спирта, эфиров, липидов и аминогрупп и наблюдения ферментативных взаимодействий, в то время как молекулярно-ситовая хроматография используется для определения молекулярных масс белков. Наконец, гель-хроматография (гель-фильтрация) используется для очистки РНК, частиц ДНК и вирусов.

Основной целью применения хроматографии является эффективное разделение веществ в течение подходящего временного интервала. С этой целью были разработаны колоночная (КХ) и тонкослойная (ТСХ) хроматография, бумажный, газовый и ионообменный хроматографические методы, а также гель-хроматография, осадочная хроматография, жидкостная хроматография высокого давления и аффинная хроматография. Помимо разделения хроматография может использоваться в качестве метода количественного анализа вещества.

Колоночная хроматография

Колоночная хроматография (неподвижная фаза находится на колонне), в частности, является одним из самых распространенных методов очистки белков. Процедура позволяет определить такие характеристики белков, как размер и форма, общий заряд, гидрофобные группы на поверхности и степень взаимодействия со стационарной фазой. На колонну (неподвижная фаза) наносится отделяемый образец и промывочный буфер (подвижная фаза). Специальный механизм обеспечивает их прохождение через внутренний материал колонны, размещенный на стеклопластиковой опоре. В зависимости от температуры и объема образцы скапливаются в нижней части устройства.

Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография основана на электростатических взаимодействиях между заряженными белковыми группами и твердым материалом-носителем (матрицей). Матрица имеет ионную нагрузку, противоположную нагрузке отделяемого белка, притяжение белка к колонке достигается с помощью ионных связей. Белки отделяются от колонки путем изменения рН, концентрации ионных солей, либо ионной силы буферного раствора. Положительно заряженные ионообменные матрицы называются анионообменными матрицами и адсорбируют отрицательно заряженные белки. В то время как матрицы, связанные с отрицательно заряженными группами, известными как катионообменные матрицы, адсорбируют положительно заряженные белки.

Газовая хроматография

Газовая хроматография представляет собой простой, высокочувствительный и быстрый метод для эффективного разделения мельчайших молекул. Он используется при разделении очень малых количеств анализируемых веществ. При этом методе стационарная фаза представляет собой колонну, подвижная фаза инертный газ, который пропускается через нее под высоким давлением. Анализируемый образец испаряется и переходит в газообразную подвижную фазу. Компоненты, содержащиеся в образце, диспергируются между подвижной и неподвижной фазами на твердом носителе.

Тонкослойная хроматография

Тонкослойная (твердожидкостная адсорбционная) хроматография предполагает использование в качестве стационарной фазы твердое адсорбирующее вещество, нанесенное на стеклянные пластины. Подвижная фаза перемещается через неподвижную вверх по тонкой пластине посредством капиллярного эффекта. Вместе с ней вверх перемещается смесь исследуемого вещества, ее компоненты перемещаются с разной скоростью, которая зависит от полярности материала, используемой твердой фазы и растворителя. Таким образом достигается разделение аналитов.

Если молекулы образца бесцветны, для определения их положения на хроматограмме могут быть использованы флуоресценция, радиоактивность или определенное химическое вещество. Образование видимого цвета можно наблюдать при комнатном освещении или ультрафиолетовом свете. Положение каждой молекулы в смеси можно измерить, рассчитав соотношение между расстояниями, пройденными молекулой и растворителем. Это значение измерения называется относительной подвижностью и выражается символом Rf, оно используется для качественного описания молекул.