Как увидеть биопленки. Изучение биопленок с помощью конфокального микроскопа Leica SP E

Автор: Елена Мошинец, к.б.н., с.н.с. отдела регуляторных механизмов клетки, институт Молекулярной биологии и генетики НАН Украины 

Я – микробиолог, работаю в научном институте академии наук. Мой главный предмет исследования – биоплёнки преимущественно бактерий. Я очень люблю разные виды микроскопий, но особенно я люблю конфокал! Я приложила очень много усилий, чтобы разжиться собственным лазерным конфокальным сканирующим микроскопом, и теперь он вовлечен почти во все мои проекты.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, она же КЛСМ, это эдакая супер-световая микроскопия, когда образец облучается светом, но видим мы образец не в проходящем свете, как в обычном микроскопе, а в отраженном. Для того, чтобы образец отражал, то есть, генерировал собственный свет, он окрашивается разными флуоресцентными красителями, которые начинают излучать свечение при их связывании с определёнными молекулами – белками, углеводами, ДНК. Таким образом, мы не только видим объект, но и определяем, из чего он состоит.

Ещё одно важное преимущество КЛСМ в том, что благодаря когерентности лазерных лучей мы можем делать оптические срезы объекта по фокальной плоскости, отсекая свечение вне фокуса. На практике это даёт высокую детализацию 3D структуры живого ни разу не высушенного, нарезанного или ещё как-то обработанного/изменённого объекта.

Немного о биопленках

До 90-х годов прошлого века бытовало мнение, что грибы и бактерии, особенно бактерии, живут как отдельные организмы. Но в 90-х одним смелым немецким микробиологом Костертоном было резюмировано представление о поведении бактерий в окружающем мире, и выдвинута концепция биоплёнок, которая давно уже не концепция, а признанный факт. 

Итак, бактерии не живут как индивидуалисты-социопаты, они строят города, в которых распределяют функции и противостоят окружающим невзгодам, попутно конкурируя с другими жителями в своей микронише. Именно в биоплёнках бактерии вызывают хронические инфекции, защищаются от антибиотиков и клеток иммунной системы, пребывают в анабиозе, выращивают толерантность к антибиотикам, которая всегда ведёт к появлению генетической резистентности. О биоплёнках как стратегии взаимодействия бактерий с окружающим миром можно говорить часами, поэтому лучше посмотреть. 

Это – биоплёнка дрожжевого грибка кадиды, Candida albicans, снята на конфокале. Синим цветом специфически окрашена хитиновая клеточная стенка гриба, а красным – клеточная хромосома, ДНК. Биоплёнки дрожжей не такие интересные, разнообразные и сложные как бактериальные.

А это — пятидневная биоплёнка синегнойной палочки, Pseudomonas aeruginosa. Синий сигнал – мощный полисахаридный матрикс уже зрелой биоплёнки – строительный материал, который бактерии выделяют для того, чтобы построить свой «город».

Полисахарид увлажняет биоплёнку, удерживая влагу, сорбирует токсины, не пропуская антибиотики. Красный сигнал соответствует ДНК. Но тут не всё просто: в нижнем правом углу явно видны мелкие клетки, это, собственно, бактерии, укрытые матриксом биоплёнки. Клетки содержат много ДНК, поэтому красятся полностью. А вот рваные красные «облака», укрывающие бактерии, — это внеклеточная ДНК – потрясающий механизм подавления иммунного ответа у организма-хозяина, клейкий строительный материал и депо генов устойчивости к антибиотикам прямо в нише, где живут бактерии. 

Синегнойка – лидер по использованию внеклеточной ДНК, из внеклеточной ДНК состоят её биоплёнки в первые 48 часов своего поселения в организме хозяина. Только потом подключается синтез полисахаридов (напомню, синий сигнал). Зелёный сигнал – это наши собственные исследования – специфическая окраска амилоидных фибрилл, которые тоже входят в состав внеклеточной части биоплёнки. Амилоидные фибриллы – суперскрученные практически нерастворимые белки в виде тонких палочек-фибрилл, которые тоже очень липкие, они чудесно стабилизируют внеклеточную ДНК, не давая ей «расползаться» из биоплёнки. 

В начале прошлого года мы с коллегами опубликовали этот новый уникальный супер-чувствительный краситель для визуализации т.н. функциональных бактериальных амилоидов (патологические амилоиды – бляшки в мозгу больного синдромом Альцгеймера). Я надеюсь, что эти работы на стыке физики, химии и биологии продолжаться дальше.