Вдохните новую жизнь в исследования состояния гипоксии. Внутриклеточные измерения содержания кислорода в живых клетках.

Обмен кислорода является важным физиологическим процессом, который необходим для поддержания жизнеспособности клеток и их нормального функционирования.

Гипоксия – низкое содержание кислорода в тканях, что, в значительной степени, способствует возникновению и развитию патофизиологии самых распространенных заболеваний человека, в том числе ишемии миокарда и ишемии головного мозга, рака, легочной гипертензии, врожденного порока сердца и хронической обструктивной болезни легких. Хотя значение гипоксии в биологических процессах хорошо известно, создание модельных систем для точного контроля гипоксических условий in vitro и in vivo является чрезвычайно трудным для большинства исследователей, не имеющих доступа к инструментарию, который обеспечивает точное управление и поддержание температурного режима, влажности и содержания  газов (СО2 и О2) во время эксперимента. К счастью, EVOS ™ FL Auto Imaging System с внешним СО2-инкубатором обеспечивает исследователей простой в использовании платформой которая позволяет точно контролировать уровень кислорода, тем самым дает возможность оценить клеточный ответ на гипоксию путем флюоресцентной визуализации живых клеток с использованием ImageiTHypoxia Reagent (Рис 1).

Evos

Особо важными вопросы гипоксии проявляются в плоскости изучения патологических опухолевых процессов. Адаптация к состояниям гипоксии является жизненно важной для развития опухоли и ее выживаемости [[i]]. В проблеме гипоксия и опухолевый рост имеет место определенный парадокс: с одной стороны, гипоксия как неблагоприятный фактор для клеток и тканей должна стимулировать апоптоз и элиминировать погибающие клетки, с другой, — как следует из многочисленных наблюдений, гипоксия стимулирует опухолевую прогрессию. Кроме того, само нарушение нормального хода  биохимических реакций в условиях гипоксии, может привести к лейкозным преобразованиям [[ii]]. Гипоксических ответы также имеют важное значение для нормального развития кроветворных стволовых клеток, которые постоянно находятся внутри гипоксического микроокружения костного мозга. Сигнальные пути, реализуемые при гипоксии, являются предопределяющими для последующей дифференциации клетки ведущей к нормальному гемопоэзу [[iii]]. Адаптация к гипоксии опосредуется в основном за счет активации транскрипции генов, которые облегчают краткосрочные (например, транспорт глюкозы) и долгосрочные (например, ангиогенез) адаптационные механизмы. Ключевым регулятором клеточного ответа в условиях гипоксии является транскрипционный фактор HIF-1 (гипоксия индуцируемый фактор-1), который функционирует в качестве главного регулятора клеточного и системного ответа на гипоксию через активацию транскрипции широкого спектра генов, в том числе участвующих в энергетическом обмене, ангиогенезе и эритропоэзе, а также генов, белковые продукты которых увеличивают доставку кислорода к целевым клеткам или способствуют метаболической адаптации к гипоксии.


[i] Giaccia AJ, Simon MC, Johnson R (2004) The biology of hypoxia: the role of oxygen sensing in development, normal function, and disease. Genes Dev 18:2183–2194.

[ii] Gezer D, Vukovic M, Soga T et al. (2014) Concise review: genetic dissection of hypoxia signaling pathways in normal and leukemic stem cells. Stem Cells 32:1390–1397.

[iii] Rankin EB, Giaccia AJ, Schipani E (2011) A central role for hypoxic signaling in

cartilage, bone, and hematopoiesis. Curr Osteoporos Rep 9:46–52.


В то время как практическая важность изучения клеточных сигнальных путей, участвующих в гипоксической реакции, четко осознана и понятна в широком диапазоне биологических применений, разработка модельных систем для точного изучения влияния низкого уровня кислорода на клетки и ткани остается технически сложной для большинства лабораторий. Один общий химико-биологический подход в изучении дерегулирующих эффектов/следствия деактивации HIF-1 включает добавление хлорида кобальта (CoCl2) в культуру клеток. CoCl2 может имитировать эффекты гипоксии путем стабилизации HIF-1 комплекса и, таким образом, активации HIF-1-индуцируемых генов. Тем не менее, CoCl2 избирательно воздействует на HIF-1-зависимые биохимические преобразования и сигнальные пути и не производит модулирующего действия на иные, индуцируемые состоянием гипоксией косвенно зависящие биохимические и функциональные процессы.

В свою очередь, методики визуализации процессов гипоксии включают использование инвазивных электродов кислорода для измерения уровня кислорода в ткани, целевых красителей HIF-1 или GLUT1 для наблюдения над косвенными признаками гипоксии в клетках, а также использование нитроимидазола, которые связывается с белками и тиолами в гипоксической ткани при состояниях острой нехватки кислорода.

В последние годы 3D культивирование in vitro позволило осуществить существенный прорыв в клеточной биологии как таковой и изучении опухолевых процессов в частности (см «Мнемосхемы жизни в трех измерениях», стр 20). Сфероида многоклеточной опухоли (MCTS) — 3D структура  с диаметром 200-500 мкм, является крайне полезной моделью для изучения биологии рака. Крайне точно имитируя физиологии малых аваскулярных опухолей [[i]], сфероиды в этой модели поддерживают химические градиенты кислорода, питательных веществ и катаболитов в таком же объеме как и опухоль в естественных условиях; Кроме того, они также обладают гистоморфологическими и функциональными особенностями, аналогичными опухолям.


[i] Kunz-Schughart LA (1999) Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biol Int 23:157–161.


Оба объекта исследований — сфероиды и опухоли — обнаруживают неоднородное распределение типов клеток, паттернов экспрессии и неоднородную физиологию функционирования. Клетки, расположенные на поверхности сфероида секретируют специфические соединения, как если бы делала это опухоль in vivo. Внутренне, сфероиды обладают тем же гипоксическим ядром коим обладают и опухоли; Это гипоксическое ядро является одной из самых изменчивых характеристик 3D культур не воспроизводимых в классических методах 2D культивирования. Таким образом, модель MCTS воспроизводит с крайней степенью достоверности модель солидных опухолей in vivo: клетки быстро перерастают кровоснабжение, в результате чего центр опухоли функционирует с крайне низкой концентрации кислорода (рисунок 2).

1

Рисунок 2. Опухолевые сфероиды визуализированы с использованием Image-iT Hypoxia Reagent.

(А, В) HeLa клетки выращивались на 96-луночных планшетах Thermo Scientific ™ Nunclon ™ SPHERA ™ с U-образным дном в течение 2-х дней для образования сфероида. Сфероиды инкубировали в присутствии 5 мкМ Image-iT Hypoxia Reagent  (красный, кат. No. H10498) в течение 3 ч. NucBlue™ Live ReadyProbes™ Reagent (blue, Cat. No. R37605) был использован в качестве ядерного контрастирующего красителя. Изображения были получены на ™ FL Auto Imaging System Evos.

(C), HeLa клетки наращивались на NanoCulture пластинах (Scivax Life Sciences) в течение 6 дней для образования сфероида, а затем сфероиды окрашивали 10 мкМ Image-iT Hypoxia Reagent в течение 1 часа. Изображения были получены на конфокальном микроскопе Цейсс ™ LSM 710. Гипоксические состояния в ядре сфероидов представлены красным окрашиванием.

EVOS FL Auto Imaging System with Onstage Incubator:

Визуализация живых клеток в инкубаторах с точно контролируемыми уровнями кислорода, обычно производится в условиях низких концентраций кислорода, с целью обеспечения долгосрочного роста клеток в условиях гипоксии. Тем не менее, в режиме реального времени визуализации клеточных процессов в ответ на гипоксические условия становится проблематичной при переносе клеток из инкубатора в микроскоп с целью получения изображения. Мало того, что трудно достичь точного контроля уровня кислорода в инкубаторе, но и процессы реоксигенации могут приводить к получению ошибочных данных в пролонгированых процессах получения изображений гипоксических клеток. EVOS FL Auto Imaging System with Onstage Incubator включает в себя экологическую камеру, позволяющую точно контролировать уровни кислорода, температуру и влажность воздуха, тем самым обеспечивая эффективную систему исследований и оценки клеточного ответа на гипоксию в течение длительного периода времени с помощью флуоресцентных изображений живых клеток. Концентрации газов контролируются программным обеспечением системы EVOS FL Auto, что позволяет культивировать клетки с использованием точных концентраций O2 в течение продолжительного периода времени. EVOS FL Auto Imaging System крайне проста в использовании: просто введите желаемый уровень O2.

Image-iT Hypoxia Reagent: детектор кислорода в режиме реального времени

 С использованием Image-iT Hypoxia Reagent и Evos FL Auto Imaging System, визуализация живых клеток может выполняться в условиях гипоксии в режиме реального времени. Image-iT Hypoxia Reagent – флюорогеный, проникающий в клетку реагент для измерения гипоксии в живых клетках. Данное соединение не флуоресцентно в среде с нормальным содержанием кислорода (примерно 20%) и становится все более и более люминесцентным при снижении уровней кислорода. В отличие от нитроимидазола (например, pimonidazole), который реагирует только при очень низких уровнях кислорода (<1%) [[i],[ii]], Image-iT Hypoxia Reagent начинает флуоресцировать, когда уровень кислорода опускается уже ниже 5%.Image-iT Hypoxia Reagent: A real-time oxygen detector


[i] . Arteel GE, Thurman RG, Yates JM et al. (1995) Evidence that hypoxia markers

detect oxygen gradients in liver: pimonidazole and retrograde perfusion of rat liver.

Br J Cancer 72:889–895.

[ii] Gross MW, Karbach U, Groebe K et al. (1995) Calibration of misonidazole labeling by simultaneous measurement of oxygen tension and labeling density in multicellular spheroids. Int J Cancer 61:567–573.


Так как соединение быстро реагирует на изменения окружающей среды Image-iT Hypoxia Reagent может служить детектором кислорода в режиме реального времени, с флуоресцентным сигналом, который увеличивается по мере снижения уровня кислорода ниже 5% и уменьшается, если концентрация кислорода увеличивается. Кроме того, Image-iT Hypoxia Reagent очень прост в использовании; просто добавьте его в среду для культивирования клеток и визуализируйте с помощью системы визуализации или микроскопа. Обладающий вышеописанными свойствами реагент является идеальным инструментом для обнаружения гипоксических условий в опухолевых клетках, 3D культурах, сфероидах нейронов и других тканях, используемых как объекты визуализации в исследованиях гипоксии. Реагенты с аналогичными свойствами, как показано, уже эффективно используются в обнаружении опухолей у мелких животных, кроме того их флюоресцирующие свойства коррелируют с повышением экспрессии HIF-1α и его транслокацией в гипоксических условиях [[i]].


[i] Zhang S, Hosaka M, Yoshihara T et al. (2010) Phosphorescent light-emitting iridium complexes serve as a hypoxia-sensing probe for tumor imaging in living animals. Cancer Res 70:4490–4498.

Иммунодетекция HIF-1 в фиксированных клетках

При постановке эксперимента по визуализации фиксированной клетки, экспрессия HIF-1 используется в качестве маркера для мониторинга состояния жизнеспособности клеток после воздействия гипоксии. HIF-1α mouse monoclonal antibody обеспечивает высокоспецифичный зонд для оценки экспрессии HIF-1 в образцах фиксированных клеток. Thermo Scientific ™ под брендом Pierce ™  предлагает ряд антител которые распознают HIF-1 и были верифицированы для работы различными методиками в том числе иммуноцитохимией (ICC), иммуногистохимией (IHC), Вестерн-блоттом и иммунопреципитацией;

Ускорение темпов исследования гипоксии

EVOS FL Auto Imaging System with Onstage Incubator позволяет точно контролировать концентрации кислорода, преодолевая технические препятствия, которые досаждали исследования гипоксия в прошлом. Эта easy-to-use система в сочетании с Image-iT Hypoxia Reagent, идеально подходит для изучения роли клеточных реакций организма на гипоксию в норме и патологии. Посетите www.thermofisher.com/evosflauto и скачайте пошаговую инструкцию для создания гипоксических условий с использованием Evos FL Auto Imaging System with Onstage Incubator.