Лабораторное сопровождение трансплантации является неотъемлемой частью этого процесса. Применение адекватных современных и валидированных рутинных технологий обеспечивает успех трансплантации органов, более продолжительную полноценную жизнь как графта/гемопоэтических клеток, так и, собственно, пациента, уменьшает стоимость и продолжительность посттрансплантационного лабораторного мониторинга и медицинского сопровождения пациента после проведения трансплантации.
трансплантации в Украине в 2020 году
При подборе пары донор-реципиент, а также для создания донорских реестров возникает задача проведения HLA-типирования как первого этапа порядка поиска совместимого донора в рутинной трансплантации (*порядок поиска и протокол может отличаться в случае ургентной трансплантации – см. соответствующие приказы Минздрава):
Серологические методы HLA-типирования
Серологические методы основаны на идентификации молекул МНС, экспрессированных на мембране, посредством специфических антител. На практике серологическое типирование является последним этапом (!!!!) и проводится на выделенных клеточных популяциях. Поскольку основными носителями антигенов МНС являются лимфоциты, суспензию Т-лимфоцитов используют для определения антигенов класса I, а суспензию В-лимфоцитов – для определения антигенов класса II гистосовместимости. Наиболее распространенным методом типирования HLA-антигенов является лимфоцитотоксический тест «кросс-матч», модифицированный Полем Терасаки и в последнее время, благодаря развитию методологий, проводится двумя лабораторными подходами:
Стандартный лимфоцитотоксический кросс-матч в плашках Терасаки с применением инвертированной микроскопии для анализа
Принцип лимфоцитотоксического теста (кросс-матч) основан на способности специфических антител взаимодействовать с HLA-антигенами соответствующей специфичности антител, образуя комплекс «антиген-антитело». Связывание комплемента с комплексом антиген-антитело запускает каскад реакций, что приводит к повреждению клеточной мембраны и лизису клеток. При отрицательной реакции лимфоциты остаются невредимыми. При положительной реакции лимфоциты разрушаются. Визуализация положительной реакции производится с помощью суправитальных красителей (эозин, трипановый синий) или на более современном уровне с помощью флуоресцентных красителей. Определение фенотипа HLA – осуществляется по совокупности положительных и отрицательных реакций.
Для кросс-матч используются моноклональные антитела или панель диагностических сывороток с широким спектром антител к HLA-антигенам различных специфичностей. Диагностические сыворотки с HLA-антигенами получаются от иммунизированных доноров. Иммунизация может быть вызвана беременностью (у 10-20% беременных производятся антитела к родительским HLA-антигенам HLA гаплотипа плода), переливанием крови или трансплантацией органов. Направленная иммунизация доноров пересадкой кожи, переливанием крови или лейкоцитарной массы приводит к появлению высокоактивных антител к HLA-антигенам.
Схема снижения активности трансплантаций в связи с COVID
Протоколы выделения Т и В лимфоцитов для дальнейшего проведения серологического кросс-матча
А) Выделение HLA класс I и класс II антиген-экспрессирующих клеток из цельной крови с помощью магнитных частиц Dynabeads™ HLA CLASS I и/или CLASS II (21001D, 21002D, 21003, 21004D) на магнитном штативе
Реагенты и оборудование:
Пошаговая процедура:
Приготовление образцов (выделение из кольца лимфоцитов)
Приготовление образцов (выделение из цельной крови)
Выделение клеток
Б) Выделение Т лимфоцитов с помощью специфического реагента FluoroBeads®-Т
Реагенты и оборудование:
Пошаговая процедура:
Выделение из цельной крови
В) Выделение В лимфоцитов с помощью специфического реагента FluoroBeads®-B
Реагенты и оборудование:
Пошаговая процедура:
Выделение из цельной крови
О процедуре проведения серологического кросс-матча подробно расскажем в следующей статье.