Гистологическое исследование включает процедуру отбора небольшого образца ткани для исследования, которое обычно проводится патологоанатомом, и быстрого погружения в раствор фиксатора надлежащих свойств.
Гистологический материал требует тщательной подготовки. Она проходит в несколько этапов:
- фиксация;
- проводка;
- заливка;
- резка (микротомия);
- окрашивание;
- заключение.
Фиксация
Процесс фиксации заключается в сохранении структуры и характерных особенностей ткани и предупреждение процесса аутолиза. Очень важно использовать раствор фиксатора, что обеспечивает сохранение тканей и клеток в максимально приближенном к живому состоянии с помощью устойчивых химических соединений.
Для гистологического анализа кожи, в качестве фиксатора выступает вещество со следующими свойствами:
- быстро проникает в ткани;
- фиксирует все части клеток;
- позволяет использовать все виды красителей.
Идеальный фиксатор должен не только образовывать стабильные соединения со всеми этими веществами, но и делать их нерастворимыми как в жировых растворителях, так и в воде. Фиксация всегда приводит к большим или меньшим изменениям структуры и объема ткани, степень выраженности которых зависит от рН фиксатора, его концентрации, температуры, продолжительности воздействия и других факторов. Концентрация ионов водорода фиксатора должна соответствовать таковой в тканях, поэтому фиксатор должен иметь рН, близкий к нейтральному. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 10-20 раз, так как тканевая жидкость может существенно изменить концентрацию фиксатора.
Читайте также: Микроскопы Leica: обзор решений для биомедицинских исследований
Формалин
Один из самых распространенных фиксаторов в гистологии. Его действие заключается в соединении мембранных белков путем образования ковалентных связей. Он производится путем разбавления коммерческого формальдегида в водном фосфатном буфере. Обычная концентрация составляет 10% (или 4% формальдегида). Вещество быстро проникает внутрь, не разрушает ни один из клеточных компонентов и позволяет использовать практически все методы окрашивания.
Для оптимального эффекта фиксации различных тканей рекомендуется использовать формалин 10% с нейтральным уровнем pH (например, Формалин гистологический 10% Leica Neutral Buffered Formalin)
Формалин гистологический 10% Leica Neutral Buffered Formalin
Проводка (обезвоживания, инфильтрация) и заливка в парафин
Для обезвоживания материала обычно используют несколько порций этилового спирта восходящей крепости.
Для удаления спирта и подготовки к пропитыванию парафином материал обрабатывают одним из растворителей парафина, обладающим способностью вытеснять спирт. К таким веществам относятся ксилол, который должен быть хорошо очищенный (например, Ксилол для гистологии, очищенная смесь Surgipath Xylenes, 5 л/уп, Leica Biosystems).
очищенная смесь Surgipath Xylenes
Для полного насыщения ткани парафином кусочки ткани проводят последовательно через две-три порции расплавленного парафина (процесс инфильтрации). Для качественного процесса инфильтрации и последующей заливки необходимо использовать парафин, содержащий в своем составе полимерные частинки для его необходимой вязкости (например, Парафин гистологический Leica Formula R, 0,9 кг/уп, Leica Biosystems)
Парафин гистологический Leica Formula R
Время пребывания в парафине зависит от величины кусочков ткани и их свойств.
Читайте также: Как правильно чистить оптику микроскопа
Резка (микротомия)
Гистологический анализ предполагает особое внимание к процессу нарезания, поскольку достаточно тонкие срезы обеспечивают четкость и точность исследования мельчайших деталей клеток с помощью световых микроскопов.
Резка осуществляется специальными инструментами, микротомами, преимущественно роторными, которые способны делать надрезы толщиной от 1 µm.
В процессе резки (микротомии) особое внимание нужно обращать на качество лезвий. Они должны быть выбраны в зависимости от типа держателя лезвий в микротоме (низкий профиль, высокий профиль) и должны быть качественные для возможности создать препарат без недостатков (например, для низкопрофильных – Сменные лезвия Leica для микротомов, тип 819, низкий профиль, 50 шт/уп, Leica Biosystems)
Сменные лезвия Leica для микротомов
Окрашивание
При работе со световым микроскопом трудно распознать различные компоненты клеток и тканей без дифференциального окрашивания. Метод окрашивания выбирается в соответствии с задачами исследования, чтобы выделить определенные ткани или органеллы. Самым распространенным методом окраски является окраска H&E (гематоксилин-эозин). Для качественной окраски препарата нужно использовать качественные красители, которые придают равномерную окраску и не требуют фильтрации (для удобства) (например, Гематоксилин Джилла II Leica Surgipath GIll II Hematoxylin, 1 л/уп, Leica Biosystems и Эозин спиртовой Leica Surgipath Eosin Y, 1 л/уп, Leica Biosystems)
Гематоксилин Джилла II Leica Surgipath GIll II Hematoxylin
Чтобы сохранить уже окрашенный препарат, его покрывают тонким слоем прозрачного вещества, затвердевающего и в дальнейшем препятствующего повреждению препарата (средой для заключения). Это вещество должно иметь в своем составе антиоксиданты, чтобы предупредить выцветание окраски препарата и иметь показатель преломления, аналогичный показателю преломления стекла, чтобы предотвратить искажение (например, Среда для заключения препаратов под стекло Leica MicroMount, 473мл/уп, Leica Biosystems).
Среда для заключения препаратов под стекло Leica MicroMount
Роль в диагностике патологий
Гистопатология – это раздел гистологии, который специализируется на микроскопической идентификации и исследовании пораженных тканей.
Гистологическое исследование – это один из распространенных способов диагностики патологических состояний. Результаты исследования предоставляют информацию о характере патологии, ее состоянии и в некоторых случаях чувствительности к определенным методам лечения.
Современная диагностика позволяет осуществлять гистологическое исследование кожи и внутренних органов, тем самым помогая поставить точный диагноз, который поможет сохранит жизнь пациента.