Гістологічне дослідження включає процедуру відбору невеликого зразка тканини для дослідження, яке зазвичай проводиться патологоанатомом, і швидкого занурення в розчин фіксатора відповідних властивостей.
Гістологічний матеріал вимагає ретельної підготовки. Вона проходить в кілька етапів:
- фіксація;
- проводка;
- заливка;
- різання (мікротомів);
- фарбування;
- висновок.
Фіксація
Процес фіксації полягає в збереженні структури і характерних особливостей тканини і попередженні процесу аутолізу. Дуже важливо використовувати розчин фіксатора, що забезпечує збереження тканин і клітин в максимально наближеному до живого стані за допомогою стійких хімічних сполук.
Для гістологічного аналізу шкіри як фіксатор виступає речовина з наступними властивостями:
- швидко проникає в тканини;
- фіксує всі частини клітин;
- дозволяє використовувати всі види барвників.
Ідеальний фіксатор має не тільки утворювати стабільні з’єднання з усіма цими речовинами, а й робити їх нерозчинними як в жирових розчинниках, так і у воді. Фіксація завжди призводить до великих або менших змін структури і об’єму тканини, ступінь вираженості яких залежить від рН фіксатора, його концентрації, температури, тривалості впливу та інших факторів. Концентрація іонів водню фіксатора повинна відповідати такій в тканинах, тому фіксатор має мати рН, близький до нейтрального. Обсяг фіксатора має перевищувати обсяг фіксованої матеріалу в 10-20 разів, оскільки тканинна рідина може істотно змінити концентрацію фіксатора.
Читайте також: Мікроскопи Leica: огляд рішень для біомедичних досліджень
Формалін
Один з найпоширеніших фіксаторів в гістології. Його дія полягає в з’єднанні мембранних білків через утворення ковалентних зв’язків. Він проводиться шляхом розчинення комерційного формальдегіду у водному фосфатному буфері. Звичайна концентрація становить 10% (або 4% формальдегіду). Речовина швидко проникає всередину, не руйнує ні один з клітинних компонентів і дозволяє використовувати практично всі методи фарбування.
Для оптимального ефекту фіксації різних тканин рекомендується використовувати формалін 10% з нейтральним рівнем pH (наприклад Формалін гістологічний 10% Leica Neutral Buffered Formalin)
Формалін гістологічний 10% Leica Neutral Buffered Formalin
Проводка (зневоднення, інфільтрація) і заливка в парафін
Для зневоднення матеріалу зазвичай використовують кілька порцій етилового спирту висхідної міцності.
Для видалення спирту та підготовки до просочування парафіном матеріал обробляють одним з розчинників парафіну, що має здатність витісняти спирт. До таких речовин відносяться ксилол, який повинен бути добре очищений (наприклад, Ксилол для гістології, очищена суміш Surgipath Xylenes, 5 л / уп, Leica Biosystems).
Ксилол для гістології, очищена суміш Surgipath Xylenes
Для повного насичення тканини парафіном шматочки тканини проводять послідовно через дві-три порції розплавленого парафіну (процес інфільтрації). Для якісного процесу інфільтрації і подальшого заливання необхідно використовувати парафін, який містить в своєму складі полімерні частинки для його необхідної в’язкості (наприклад, Парафін гістологічний Leica Formula R, 0,9 кг / уп, Leica Biosystems)
Парафін гістологічний Leica Formula R
Час перебування в парафіні залежить від величини шматочків тканини і їхніх властивостей.
Читайте також: Як правильно чистити оптику мікроскопа
Різка (мікротомів)
Гістологічний аналіз передбачає особливу увагу до процесу нарізування, оскільки досить тонкі зрізи забезпечують чіткість і точність дослідження найдрібніших деталей клітин за допомогою світлових мікроскопів.
Різка здійснюється спеціальними інструментами, мікротомами, переважно роторними, які здатні робити надрізи товщиною від 1 μm.
У процесі різання (мікротомів) особливу увагу потрібно приділяти якості лез. Обирати їх слід в залежності від типу утримувача лез в мікротомі (низький профіль, високий профіль), також ці леза мають бути якісні, що дасть можливысть створити препарат без недоліків (наприклад, для низькопрофільних – Змінні леза Leica для мікротомів, тип 819, низький профіль, 50 шт / уп, Leica Biosystems)
Змінні леза Leica для мікротомів
Фарбування
При роботі зі світловим мікроскопом важко розпізнати різні компоненти клітин і тканин без диференціального фарбування. Метод фарбування вибирається відповідно до завдань дослідження, щоб виділити певні тканини або органели. Найпоширенішим методом забарвлення є забарвлення H & E (гематоксилін-еозин). Для якісного фарбування препарату потрібно використовувати якісні барвники, які надають рівномірне забарвлення і не потребують фільтрації (для зручності) (наприклад, Гематоксилін Джилла II Leica Surgipath GIll II Hematoxylin, 1 л / уп, Leica Biosystems і Еозин спиртової Leica Surgipath Eosin Y, 1 л / уп, Leica Biosystems).
Гематоксилін Джилла II Leica Surgipath GIll II Hematoxylin
Щоб зберегти вже пофарбований препарат, його покривають тонким шаром прозорої речовини, яка затвердіває і попереджує пошкодження препарату. Ця речовина має містити антиоксиданти, щоб попередити вицвітання забарвлення препарату і мати показник заломлення, аналогічний показнику заломлення скла, щоб запобігти спотворенню (наприклад, Середовище для укладення препаратів під скло Leica MicroMount, 473мл / уп, Leica Biosystems).
Середовище для укладення препаратів під скло Leica MicroMount
Роль в діагностиці патологій
Гістопатологія – це розділ гістології, який спеціалізується на мікроскопічної ідентифікації та дослідженні уражених тканин.
Гістологічне дослідження – це один з поширених способів діагностики патологічних станів. Результати дослідження надають інформацію про характер патології, її стан і в деяких випадках чутливість до певних методів лікування.
Сучасна діагностика дозволяє здійснювати гістологічне дослідження шкіри і внутрішніх органів, тим самим допомагаючи поставити точний діагноз, який допоможе зберегти життя пацієнта.
